环介导等温扩增技术及其在鸡病珍断中的应用

魏晓媛　李杰峰　颜国华　杨玉增　房国芳　符　乐

(河北省畜牧兽医研究所,河北保定　071000)

环介导等温扩增技术及其在鸡病珍断中的应用

魏晓媛李杰峰颜国华杨玉增房国芳符乐

(河北省畜牧兽医研究所,河北保定071000)

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP)是一种体外等温扩增核酸片段的新技术,利用4条特异性引物,在BstdNA聚合酶的催化下能够有效地扩增出靶基因.与常规PCR法相比该法具有特异性强、灵敏度高、快速准确以及操作简便等优点,现已广泛应用于动物疾病检测中.此文综述了LAMP技术原理及其在鸡传染性疾病病原检测中的应用,旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。

环介导等温扩增技术鸡病检测环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP),是2000年由日本Notomi[1]等人研发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,其最大的优势是省去了烦琐的热变性过程,通过BstDNA聚合酶的链置换反应在等温条件下即可完成扩增反应.由于针对靶基因的6/8个特异性区域设计4/6条引物使其具有高度的特异性.LAMP具有高效、特异性强、操作简单和廉价简易等优点,在1 h左右就可将靶基因扩增109～1010倍.通过肉眼观察到的白色衍生物-在DNA延伸合成时产生的焦磷酸镁,就可确定靶基因的扩增与否.LAMP扩增技术适合一些偏远的基层机构,因为它不需要昂贵的仪器设备,对实验条件要求不高,并且对操作人员的技术水平要求不高,所以,具有广泛的推广价值和应用前景。

1　LAMP技术基本原理

环介导等温扩增反应(LAMP)是在等温条件及BstDNA聚合酶的催化下利用4条特异性引物高效扩增靶基因DNA.其反应体系包括模板dNA、dNTPs、引物、BstdNA聚合酶和缓冲液,在60℃～65℃保温60 min左右,然后在高于80°C的温度下加热10 min即可终止反应。

四条引物由内引物FIP、BIP及外引物F3、B3组成,其中FIP又由F1c和F2组成,BIP又由B1c和B2组成.这四条引物针对靶基因上的六个特异性的区域进行设计,这六个特异性的区域分别是位于3'端的F3c区段、F2c区段、F1c区段和位于5'端的B1区段、B2区段、B3区段。

LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、延伸和再循环阶段.在LAMP哑铃状模板合成阶段,内引物FIP上的F2序列与模板DNA的F2c结合,在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下合成了DNA互补链,同时外引物F3与模板DNA的F3c互补引导合成模板DNA的互补链.此时由FIP引导合成的互补链因为置换反应被释放出来,其Flc和F1区互补形成茎环状结构.引物BIP的B2序列与该单链的另一端B2c区域互补配对引导合成该链的互补链,然后B3与B3c互补配对开始类似于F3的反应.而这条被置换下来的由FIP/BIP引导合成的单链两端存在碱基互补序列,使两端自动成环故其使整条链形成哑铃状结构。

在LAMP循环扩增阶段,这种哑铃结构的DNA为循环反应提供了原料,首先是以哑铃形结构中3'端的F1区段为起点,并以自身为模板引导DNA的合成.同时,引物FIP上的F2区段与茎环DNA的环状结构上的F2c结合,启动新一轮链置换反应,并解离先前由F1引导合成的DNA链,此DNA链也会形成环状结构.在延伸和再循环阶段,引物BIP的B2区段与环上的B2c区段结合,开始新一轮的链置换反应.经过不断地重复相同的循环过程,使茎环个数逐渐增加,最终形成大量大小长度不一的结构。

2　LAMP扩增结果的检测方法

常用的检测方法一般有以下4种:

(1)肉眼观察法:LAMP反应过程中,在核酸大量生成的同时其衍生物也随之而生,从dNTPs中析出的焦磷酸根离子和反应液中的Mg2+结合,产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。

(2)琼脂糖凝胶电泳的检测方法:LAMP的反应产物为大小不一的DNA片段,所以其扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现典型的梯形条带,而不只是一条带。

(3)荧光检测法:SYBR green I是高灵敏的DNA荧光染料,其与双链DNA的亲和力非常高,一旦结合便会产生在紫外灯或日光下可见的绿色荧光信号.反之,则保持橙色不变。

(4)浊度仪:研究表明,焦磷酸镁沉淀在 400nm处有吸收峰,利用 LAMP 反应中焦磷酸镁沉淀与所合成dNA 量之间的线性关系,通过实时浊度仪监测沉淀的形成量,对反应中dNA 的合成量进行反推,从而对AMP可进行实时监测和定量[2]。

3　LAMP技术在鸡病毒性疾病检测中的应用

3.1禽流感

禽流感是禽流行性感冒的简称,它是由A型流感病毒引起的一种急性传染病,可感染许多种肉用禽类,也可感染人.王辰雨等[1]根据禽流感病毒的M基因设计了LAMP引物,初步建立了该病毒的LAMP检测方法,结果表明该方法的检测极限为100fg,且能够特异性地检出H9亚型禽流感病毒;同时还将该方法与病毒分离法和常规RT-PCR法用于排毒规律的研究并进行比较分析,结果表明LAMP法与病毒分离法及RT-PCR法的符合率较高分别为96.7%、98.3%。

3.2鸡新城疫

新城疫(Newcastledisease,ND)是由ND病毒引起的主要侵害鸡和火鸡等禽类的一种急性、高度接触性传染病,严重危害我国禽类养殖业.杜景娇等[2]将NDVF基因作为靶基因设计引物,并优化反应体系,建立了NDV的RT-LAMP快速检测方法.该法在恒温65℃条件下,反应30min即可完成扩增,且对传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒的扩增结果均为阴性.该法比RT-PCR方法敏感100倍。

3.3鸡传染性支气管炎

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Broncheitis,IB)是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病.刘宇卓等[3]根据IBV衣壳蛋白M基因保守区域设计了2对特异性引物,通过对反应体系的优化建立了IBV的环介导逆转录等温检测方法.试验表明:该法对IBV的最小检测量为12fg并且对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、坦布苏病毒及正常鸡胚尿囊液的检测均为阴性;其特异性强、灵敏度高,可作为鸡传染性支气管炎的快速诊断方法.罗思思等[4]根据LAMP原理所建立的IBV RTLAMP可视化检测方法对IBV RNA最小检测限为10fg,其灵敏度高于常规PCR法100倍.反应可在1h内全部完成,并通过在反应体系中添加SYBR green I染料后,肉眼观察有无荧光而直接判定结果。

3.4禽白血病

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称.夏永恒等[5]根据Genbank中公布的J亚群白血病NX0101株的保守区域运用Primer Explorer Version3设计特异性的LAMP引物,包括内引物(F3、B3)、外引物(FIP、BIP)、环引物(LF、LB),其环引物可加速反应速度从而缩短反应时间.其LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍.将该方法用于临床样本检测且与PCR方法进行比较,结果表明LAMP检测结果与PCR基本相符,但检测的阳性率高于PCR.康忠惠[6]分别对GenBank中A亚群禽白血病病毒及B亚群禽白血病病毒序列进行比对,同时比较其他亚群的相应区域,最终选择gp85区段进行引物设计.通过反应条件的优化使得LAMP方法对A、B亚群白血病通过相应的引物设计均可成功扩增,且对C、E、J亚群及其他禽类常见传染病的检测结果为阴性,证明该方法的特异性极强.所建立的ALV-A LAMP体系在45min内可检测出20个拷贝的病毒核酸,比PCR敏感100倍;所建立的ALV-B LAMP体系在80min内可检测出4000个拷贝的病毒,与PCR敏感度相当.此研究在反应液配制过程中直接加入荧光染料FDR,故在反应结束后可根据颜色的变化直接判定实验结果,大大降低假阳性的发生概率。

3.5鸡传染性贫血病

鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)引起雏鸡的以再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为特征的一种免疫抑制性疾病,对养鸡业危害很大.邓显文等[7]基于CIAV的VP2基因序列设计了6条特异性引物,可在50min内快速检测鸡传染性贫血病,通过在反应体系中加入Calcein+MnCl2使扩增产物呈肉眼可见的翠绿色,而阴性对照组呈橘红色.吴焕荣等[8]根据鸡传染性贫血病毒基因序列cux-1:M55918设计了6条特异性引物,结果表明,LAMP能检测出最低DNA量约为0.245pg/μl,而PCR能检测出最低DNA量约为2.45pg/μl;用此方法对其他相关鸡病病原进行检测,均未发生非特异性扩增反应。

3.6鸡传染性喉气管炎

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的鸡的一种高度接触性上呼吸道传染病.谢志勤等[9]根据ILTV的TK基因序列设计了6条特异性引物,同时优化了反应条件,成功建立了该病毒的LAMP检测法.用该方法对梅里亚株、广西分离株、IL-TV北京株、永顺K317株的DNA检测结果为阳性而对照组的MDV、Mass 41、E.coli O2、MG、Lasota、S1133、C48-1、、C79213的DNA/ RNA检测结果均为阴性,证明所建立的LAMP方法对ILTV具有高度的特异性.此研究同样也进行了敏感性试验,结果表明该方法比常规ILTV PCR高10倍。

3.7鸡传染性法氏囊病

传染性法氏囊病(Infectious Bursaldisease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursaldisease Virus,IBDV)引起的危害雏鸡的一种急性、高度接触性、病毒性传染病,主要侵害鸡的中枢免疫器官--法氏囊.杨作丰等[10]针对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP1基因保守区域的6个特异性部位利用Primer ExplorerV4软件设计了4条引物,从而建立了IBDV的反转录环媒恒温检测方法.在65℃等温条件下反应1h后,其反应产物在2%琼脂糖凝胶电泳可得特有的阶梯状条带.此方法对IBDV的最低检出量是10-6稀释倍数,敏感性极强是普通RT-PCR的100倍.在检测临床样品方面,其与普通RT-PCR方法的符合率为93.8%。

3.8网状内皮组织增生症

网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的免疫抑制性和致瘤性疾病.在养殖场中REV常与鸡贫血病毒、J-亚群禽白血病病毒和马立克氏病病毒混合感染,这使得鸡群免疫力下降,从而导致新城疫、禽流感等疫苗免疫失败,还将导致继发感染,这使疫病的诊断和防控难度加大.邓小芸等[11]根据REV pol基因的6个特异性位点设计了4条引物,建立了针对该病毒的LAMP检测方法.该法比常规PCR方法灵敏25倍并且与常见的感染鸡群的DNA病毒及ALV-J不发生交叉反应.其操作简单,无须复杂仪器,简单水浴锅即可且临床样品检测效率与PCR方法相当,肉眼可观察检测结果。

3.9禽呼肠孤病毒感染

禽呼肠孤病毒感染(Avian reovirus infection,ARV)是呼肠孤病毒感染并引起鸡的多种疾病,包括呼吸道疾病、病毒性关节炎、肠道疾病、矮小综合征和吸收不良综合征.王莹[12]在ARV的S1基因序列的保守区域设计了3对引物,分别为内引物、外引物和环引物,从而建立了检测AVR的LAMP方法.试验结果表明:该法能检测出1个拷贝的pMD-18T-S1阳性质粒,敏感性很高.将该法与RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR及半套式RT-PCR进行比较,结果表明RT-PCR最低能检测到103个拷贝/μl的质粒, 10pg的RNA,实时荧光定量RT-PCR、半套式RT-PCR、RT-LAMP均能最低检测到100个拷贝/μl的质粒,lOfg的RNA.由此可以得出,核酸检测方法中,实时荧光定量RT-PCR、半套式RT-PCR、LAMP的敏感度极高。

4　LAMP技术在鸡细菌性疾病检测

4.1用于金黄色葡萄球菌的检测

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是革兰氏阳性菌的代表,属于葡萄球菌属(Staphylococcus),是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一.由于其广泛存在于自然界中,故中毒食物的种类非常多,如人们日常食用的肉、蛋、奶.因此,建立一种快速、有效的检测方法可提高人类的健康水平.唐梦君[15]等根据金黄色葡萄球菌nuc基因的保守区域设计特异性引物,所建立的LAMP体系在65℃的等温条件下,仅需45min即可扩增出LAMP所特有的阶梯状条带且用该方法对240份鸡蛋样品进行检测,12份蛋壳金黄色葡萄球菌检测阳性,蛋内容物均未检出,其检测结果与国标方法相符合。

4.2肠出血性大肠杆菌的检测

肠出血性大肠杆菌是一种人畜共患病病原,该菌的传播途径有食源性、水源性及接触传播,类型多且血清型复杂,而传统的检测方法如酶联免疫技术、免疫磁珠分离法、蛋白芯片技术等免疫学检测方法及聚合酶链反应(PCR)技术、实时荧光PCR技术、基因芯片技术等分子生物学难以快速检测出该菌.张雪寒[16]等针对rfbE基因设计引物并建立反应体系,该体系在1h内便可通过肉眼观察检测结果.试验结果表明该体系对0157菌液和模拟阳性样品的检测灵敏度分别为1CFU/ml和1CFU/g.用沙门杆菌及其他血清型大肠杆菌DNA作为模板对rfbE基因进行特异性试验的检测,其特异性为100%。

4.3单核细胞增生性李斯特氏菌

单核细胞增生性李斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致病菌.袁耀武[17]等基于单核细胞增生性李斯特氏菌的李氏溶血素基因(Hly),设计两对特异性引物,并通过LAMP技术对其进行扩增.运用LAMP对单核细胞增生性李斯特氏菌纯培养进行检测,其方法的灵敏度为7.3X101cfu/ml;而利用LAMP检测人工污染的鸡肉中的单核细胞增生性李斯特氏菌,检出限为8.9X101cfu/g.张亚爽[18]分别用LAMP法和PCR法检测单核细胞增生性李斯特氏菌,实验结果表明:PCR和LAMP方法的灵敏度分别为1.47X102cfu/ml和7.3X10cfu/ml.利用PCR技术和LAMP技术直接检测人工污染的鸡肉中的单增李斯特,检出限分别为9.6X102cfu/g和8.9X10cfu/g。

5　LAMP技术用于鸡支原体疾病检测中的应用

5.1鸡滑液支原体

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)以侵害鸡关节滑液、腱鞘膜和气囊为主,引起鸡亚临床型的上呼吸道感染和关节滑液囊炎.邓显文等[19]建立了MS的LAMP可视化检测方法,该方法所使用的引物是根据GenBank中MS热休克ATP依赖蛋白酶基因的保守序列所设计的.将反应体系在62℃水浴锅中反应1h,最低可检测到100拷贝的目的DNA,其敏感性比常规PCR法高10倍.而且此研究使用的染料为Calcein+MnCl2,它可在配制LAMP反应液时直接加入从而避免了传统的LAMP方法需要在反应结束后加入荧光染料SYBR greenI所造成的二次污染.反应结果肉眼即可观察,阳性样品为翠绿色,阴性为橘红色。

5.2鸡毒支原体强毒和弱毒株检测

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡及其他禽类慢性呼吸道疾病的主要病原,感染鸡群常出现哕音、咳嗽、流鼻涕等症状,可引起鸡生长速度下降,肉鸡胴体品质下降和种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等,给养禽业造成较大的经济损失[20-21].MG强毒株和弱毒疫苗株的鉴别检测对于MG的防治非常重要.罗思思等[22]根据MG强弱毒株碱基保守性与差异设计了MG强弱毒株通用的LAMP引物序列及MG弱毒的LAMP引物序列.其强弱毒通用LAMP方法对鸡毒支原体的强弱毒株均可检测,弱毒LAMP方法只可检测到弱毒.两种检测方法与常见的禽类呼吸道病和其他支原体均不存在交叉反应,具有特异性强、灵敏度高适于基层快速鉴别MG强、弱毒株的检测方法。

6　展望

LAMP技术是一种新型的核酸扩增技术,该方法对实际操作人员的技术水平要求不高且不需要昂贵的仪器设备,实验结果可通过肉眼观察直接得出.因其快速、高效且廉价的特性被广泛应用于各个领域.但在实际操作中有时会出现假阳性的问题,若在此方面进一步优化和改善,该技术必将在食品微生物检测、动物疫病检测及耐药性基因等方面发挥不可替代的重要作用。

[1]王辰雨.禽流感病毒LAMP检测方法的建立及初步应用[D].山东农业大学,2014.

[2]刘宇卓,韩凯凯,李银,等.鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].江苏农业学报,2013,29(4):818-821.

[3]罗思思,谢芝勋,庞耀珊,等.鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].中国农学通报,2012,28(20): 83-87.

[4]夏永恒,杨兵,张杰,等.2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立[J].中国动物检疫,2009,26(5):29-32.

[5]康忠惠.A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用[D].东北农业大学,2011.

魏晓媛(1987-),女,河北元氏人,兽医师,硕士,主要从事畜禽传染病防治研究。