犬附红细胞体的病原学特性研究进展

王焕军

(山东省诸城市诸城畜牧兽医管理局,山东诸城　262200)

犬附红细胞体的病原学特性研究进展

王焕军

(山东省诸城市诸城畜牧兽医管理局,山东诸城262200)

近年来随着养犬业的发展,犬附红细胞体的发病日益增多,不但影响家庭宠物犬的养殖,更给规模化养犬业带来了巨大的经济损失.犬附红细胞体病是由附红细胞体引起的一种人畜共患传染病,犬类感染附红细胞体后在非应急状态下一般呈隐形感染,很少表现临床症状,临床上往往与弓形体、犬瘟热等病混同,从而贻误治疗时机,本文从其病原学研究进展入手,以期提高对该病的认识和了解。

1　分类

目前,附红细胞体的归类尚未明确,《伯吉氏细菌鉴定手册》将其归于立克次氏体目,无浆体科,附红细胞体属,属细菌类.后有研究认为附红细胞体与支原体类似,应列入柔膜体纲支原体属,也有学者通过对犬附红细胞体进行形态学观察发现犬附红细胞体具有多形性,含有dNA和RNA结构,直径在0.3～2.0μm之间,为一单层限制性膜包裹的圆形结构,无明显的细胞器,无核样结构,证实附红细胞体为典型的原核生物.鉴于其分类的不明确性,很多学者建议应测定整个附红细胞体基因组序列,结合其他生物学特性确定其种属分类地位。

2　形态结构与染色特性

据扫描电镜观察,附红细胞体可附于红细胞表面,也可游离于血浆中,每个红细胞表面可附有一个或多个不等的附红细胞体,单个附红细胞体可表现球状、饼状、卵圆形等多种形态,包裹于一层限制性膜,无细胞壁和细胞核.感染附红细胞体的红细胞不再呈现双面凹的圆饼状,而是表现为表面粗糙的不规则形体,例如波浪状、星芒状、锯齿状。

附红细胞体易被苯胺类色素染色,革兰氏染色结果为阴性;瑞氏染色中,红细胞上出现深蓝色小体的为阳性,瑞士染色简单快速,但染色液中经常出现染色颗粒影响结果观察;姬姆萨氏染色中,红细胞上出现蓝紫色小体者为阳性,姬姆萨氏染色着色效果好,但是染色所需时间长且染色过程中易受染色液pH值变化的影响;吖啶橙染色过程稍复杂,荧光显微镜下观察,在红细胞边缘出现淡绿色荧光小体者为阳性,但吖啶橙染色时核仁和核碎片也可发出荧光,易出现假阳性.有研究证实,吖啶橙的检出率最高,甚至在被感染红细胞发生形体变化之前即可检出,而其他染色方法要在红细胞变形后才能检出附红细胞体.在所有姬姆萨染色检测为阳性的病例,用吖啶橙染色时均为阳性,而部分姬姆萨和瑞氏染色检测为阴性的病例中用吖啶橙染色仍为阳性,说明吖啶橙染色是较敏感的检测方法,但在实际应用中我们要考虑到染色颗粒附着带来的假阳性问题,对于临床中遇到的有争议的病例,也可采用特异性好、敏感性高的PCR等检测技术予以确认。

3　理化特性

犬附红细胞体对各种理化因素敏感,抵抗力较弱,耐低温不耐高温,低温(如-30℃)情况下部分附红细胞体可存活4个月之久,也有人报道在-70℃条件下,可保存数年,而在75℃～100℃的水浴条件下,只需30s～1min,即被全部灭活;在含氯的消毒剂中只需要作用1min,就会被全部灭活;在0.1%的碘液中会立即停止活动,而附红细胞体在1%盐酸或者5%醋酸溶液中会提高运动活性,此特征具有鉴别意义。

4　培养特性

附红细胞体分离培养比较困难,因其以红细胞作为生长载体,属于细胞依赖性体外培养,且缺乏切实有效地分离培养手段,这也是针对附红细胞体的研究较为缓慢的原因.国外有学者通过试验观察发现感染附红细胞体的红细胞对葡萄糖的消耗量增加,观察到附红细胞体在生长过程中要消耗葡萄糖,并指出附红细胞体可能是通过糖酵解的方式代谢葡萄糖,最终生成乳酸。

华修国等用血液普通肉汤、营养琼脂、沙堡弱琼脂培养基分离培养犬附红细胞体,结果均为阴性;张守法等用RPMI-1640、M-199、D-MEM3种培养液作为基础培养液,再分别按体积分数加入400 ml/L的犊牛血清配成3种完全培养基,并按体积分数为1%的比例向完全培养基中添加100mg/mL的卡那霉素,37℃恒温培养牛附红细胞体获得成功,其中在RPMI-1640培养基中,每12 h更换一次培养液,并补充适量正常红细胞,获得了99%的感染率,连续传代培养长达22d;李晓云等选用添加新生牛血清、酵母浸出液、葡萄糖等成分的PPLO肉汤,将受感染红细胞接种到细胞培养板上,37℃、5%CO2培养箱培养,定期更换培养液,除首次接种外不添加任何红细胞,连续培养达280d以上,染虫率维持近100%。

5　抗原特性

针对犬附红细胞体抗原特性研究较少,有研究对犬附红细胞体进行体外培养,培养后对解离的犬附红细胞体经超声波裂解,制备粗提抗原并提纯,对所提抗原进行SDS-PAGE及免疫印迹分析.在电泳图谱上出现了3条主蛋白带,其分子量分别为66、32和25KD,其中32和25KD的抗原具有较好的免疫性,且不与犬附红细胞体阴性血清发生交叉反应,具有较好的特异性,这可能与附红细胞体的种属特异性有关。

6　小结

目前,国内犬附红细胞体的研究较少,且缺乏研究深度.其病原学分类、附红细胞体生活史、传播途径、发病机理等都有待进一步研究,加之在临床上其发病多呈隐形感染,缺乏足够的重视,导致了该病的进一步蔓延,该病在防控上也无特效药和疫苗,只能根据临床表现进行对症治疗,而且在停药后易复发.针对抗原特异性的研究,可能会对抗原特性的深入研究以及高效疫苗甚至基因工程疫苗的研制奠定一定基础。