18α-GA通过上调蛋白酶体活性促进晚期骨髓间充质干细胞增殖*

杨佳超，　赵云鹤，　蒋　蓉，　陆　利

(山西医科大学人体解剖学教研室，山西 太原 030001)



18α-GA通过上调蛋白酶体活性促进晚期骨髓间充质干细胞增殖*

杨佳超，赵云鹤，蒋蓉，陆利△

(山西医科大学人体解剖学教研室，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 明确18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)对晚期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)衰老标志物和增殖能力的影响。方法: 晚期BMSCs(≥14代)应用2.0 mg/L的18α-GA持续作用30 d，比较18α-GA组与DMSO组蛋白酶体活性；衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和Western blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16的表达变化；CCK-8、BrdU掺入试验、流式细胞术和Western blot分别检测细胞增殖能力、细胞周期分布及细胞周期相关分子表达变化。结果: 应用18α-GA 后BMSCs蛋白酶体活性较DMSO组增高约0.2倍(P<0.01)。18α-GA组SA-β-Gal阳性衰老细胞较DMSO组减少，且细胞着色浅淡；衰老相关蛋白p53和p21表达水平分别较对照组降低(P<0.05)。CCK-8实验及流式细胞术结果显示18α-GA组细胞增殖能力较DMSO组增高，S期细胞显著增多(P<0.05)，18α-GA组BrdU染色阳性细胞率较DMSO对照组增高(P<0.05)。18α-GA组细胞周期相关蛋白cyclin D1及CDK4表达水平分别较DMSO组增高(P<0.05)。结论: 18α-GA可激活晚期BMSCs蛋白酶体活性延缓细胞衰老，并且可能通过上调细胞周期相关蛋白表达水平促进晚期BMSCs增殖。

[关键词]18α-甘草次酸； 蛋白酶体； 骨髓间充质干细胞； 细胞增殖

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是目前组织工程应用较广泛的种子细胞之一，而源自体内的BMSCs数量有限，需经体外长期培养扩增后方可用于临床移植治疗。近期的研究报道表明BMSCs存在复制性衰老，进而限制了其临床应用[1-2]。我们的前期研究结果证实蛋白酶体活性降低是BMSCs复制性衰老的重要因素[3]，增强蛋白酶体活性有助于维持BMSCs细胞活力，延缓其衰老进程[4]。18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinicacid，18α-GA)是一种源自甘草的三萜类抗氧化剂[5-8]。近期研究结果提示，18α-GA能够促进蛋白酶体亚单位的组装与合成，提高成纤维细胞的细胞活力[9]。为此，本研究拟观察18α-GA对晚期BMSCs的影响，探讨维持BMSCs细胞活力的有效途径，以期为临床应用提供数量充足的优质种子细胞。

材料和方法

1BMSCs的体外培养和18α-GA干预实验

BMSCs购自ScienCellResearchLaboratory，用含10%胎牛血清 (HyClone) 的DMEM(Gibco)培养基(内含2mmol/LL-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)培养，待细胞生长至90% 融合时进行传代。依据体外传代次数将BMSCs分为早期组(≤4)和晚期组(≥14次)。晚期BMSCs分为18α-GA实验组(2.0 mg/L的18α-GA持续作用30 d)和DMSO 溶剂对照组(等体积含DMSO的溶剂持续作用30 d)。

2实验方法

2.1蛋白酶体活性检测实验收集BMSCs，用Lysisbuffer提取蛋白质，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，依照蛋白酶体活性分析试剂盒(Millipore)说明书进行操作，荧光酶标仪激发光380nm,发射光460nm处检测分析。

2.2衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)染色检测衰老细胞将18α-GA干预完毕的BMSCs消化并调整至1×107/L，传代种于包被好的24孔板内，加新鲜培养基至1 mL，孵箱培养过夜使其贴壁，每组设3个复孔；次日，吸除旧培养基，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗1～2次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶固定液，室温固定15 min；吸除固定液，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，于摇床上轻摇；吸除PBS，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液；于湿盒内37 ℃避光孵育15～18 h；即刻于显微镜下观察、拍照。

2.3CCK-8实验和BrdU实验检测细胞增殖能力及细胞活力将细胞按照每孔2 000个接种于96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，培养孵育4 h，酶标仪450 nm处测定吸光度。

将MG132和DMSO干预处理后的细胞按照1×107/L接种于盖玻片上，用含有10μmol/LBrdU的培养基作用72h，随后进行BrdU/DAPI免疫荧光双标，荧光显微镜(Olympus-BX51)观察，计数。

2.4Westernblot实验检测衰老相关蛋白及细胞周期相关蛋白表达水平收集BMSCs细胞，提取蛋白质，BCA法测定蛋白浓度。取20μg总蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转印于PVDF膜，5%脱脂奶粉液封闭后加入I抗[p53(1∶1 000)、p21(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、兔抗cyclinD1(1∶1 000)、兔抗CDK4(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶2 000)]4 ℃ 孵育过夜，以上抗体购自康为世纪生物科技有限公司。辣根过氧化物酶偶联抗兔II抗(1∶5 000)室温杂交2h，按照化学发光检测试剂盒(GEHealthcareLifeScience)说明书曝光显影于胶片。

2.5流式细胞术检测细胞周期分布和细胞增殖指数收集BMSCs细胞，PBS清洗2次，弃上清，轻弹管壁分散细胞团，70% 冷乙醇4 ℃固定4h，1 000r/min室温离心5min弃上清，PBS重悬细胞团，300 目网过滤，加入50mg/L碘化丙啶(PI)染液(50mg/LPI，10mg/LRNase，1‰TritonX-100)，室温避光20min后流式细胞仪检测G0/G1、S和G2/M各期细胞分布。

3统计学处理

采用SPSS16.0 软件进行统计分析，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，SNK-q检验进行两两比较，两组间比较采用t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

118α-GA对晚期BMSCs20S蛋白酶体活性的影响

18α-GA组20S蛋白酶体活性较DMSO对照组显著上升约0.2倍(P<0.01)，提示应用18α-GA可上调体外扩增培养晚期BMSCs20S蛋白酶体活性，见图1。

Figure1.Theeffectof18α-GAon20Sproteasomeactivityinlate-passageBMSCs.Mean±SEM. n=3.**P<0.01 vsDMSOgroup.

图118α-GA对晚期BMSCs20S蛋白酶体活性的影响

218α-GA对晚期BMSCs衰老相关标志的影响

18α-GA组SA-β-Gal阳性细胞数量较少且着色浅淡，见图2A。Westernblot结果表明给予18α-GA后晚期BMSCs衰老相关蛋白p53和p21表达水平均较DMSO组下降(P<0.05)，但p16表达水平无显著变化，见图2B。结果提示应用18α-GA有助于延缓BMSCs衰老进程。

318α-GA对晚期BMSCs增殖能力的影响

CCK-8检测结果表明，晚期BMSCs细胞增殖能力较早期细胞显著下降(P<0.05)；但应用18α-GA后，BMSCs细胞增殖能力较DMSO对照组增高0.3倍(P<0.01)，见图3A。BrdU染色结果显示18α-GA组细胞BrdU染色阳性率较DMSO对照组增高(P<0.05)，见图3B。 流式细胞术结果也证明，18α-GA组S期细胞为显著高于DMSO对照组(P<0.05),见图3C及表1。

418α-GA对晚期BMSCs细胞周期相关蛋白表达水平的影响

Westernblot免疫印迹结果证实，18α-GA组细胞周期依赖性蛋白cyclinD1的表达水平显著增加，为DMSO对照组的2.8倍(P<0.01)，其激酶CDK4的表达水平是DMSO对照组的1.4倍(P<0.05)，见图4。结果提示应用18α-GA能够增强晚期BMSCs细胞周期相关蛋白cyclinD1和CDK4的表达水平。

讨论

18α-GA是源于甘草酸的三萜皂苷类化合物，甘草酸是常用中药甘草中最主要的活性成分之一，在胃肠道微生物中β-葡萄糖醛酸酶作用下水解成甘草次酸后被吸收，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝解毒、增强免疫功能等作用[5-8]。NargesB等[7]研究发现，18α-GA通过促进树突状细胞的成熟和调节Th1/Th2免疫应答，对抗宿主体内发生的传染病，发挥免疫调节作用。此外，还有研究证明18α-GA能够促进人乳腺癌细胞凋亡作用，抑制肿瘤细胞生长[8]。近期研究报道证明，将18α-GA作用于晚期人成纤维细胞，可以激活核因子E2相关因子2(nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2)，促使蛋白酶体亚单位β1、β2和β5转录激活，增加蛋白酶体的组装与合成，提高蛋白酶体功能活性，抵抗氧化应激，延缓晚期人成纤维细胞复制性衰老进程[9]。课题组前期研究证实，蛋白酶体活性下调是导致晚期BMSCs出现复制性衰老的重要因素，本研究显示应用18α-GA干预晚期BMSCs，能够使BMSCs蛋白酶体活性较DMSO对照组上升约0.2倍，SA-β-Gal染色衰老阳性细胞数量减少且着色较浅，提示18α-GA可以增强晚期 BMSCs蛋白酶体功能活性，延缓BMSCs复制性衰老进程。同时Chondrogianni等[10]和Arslan等[11]应用WI38成纤维细胞作为衰老细胞模型，观察蛋白酶体亚单位PSMB5过表达对细胞衰老的影响，研究结果发现提高蛋白酶体活性可增强细胞活力，延缓细胞衰老进程，与本课题组的研究结果相一致。相反，赵云鹤等[12]应用蛋白酶体可逆性抑制剂MG132抑制小鼠脑室室管膜下区蛋白酶体活性后，神经干细胞的增殖能力显著下降，进一步表明蛋白酶体活性与细胞活力密切相关。

Figure2.Delayedsenescenceprocessoflate-passageBMSCsaftertreatmentwith18α-GA.A：SA-β-Galstaining；B：Westernblotanalysisforp53,p21andp16expression.Mean±SEM. n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

图218α-GA对晚期BMSCs衰老相关标志的影响

Figure3.Theeffectof18α-GAoncellproliferationinBMSCs.A：CCK-8assay;B:BrdUincorporationassay;C:flowcytometry.Mean±SEM. n=6.#P<0.05vsearly group；*P<0.05,**P<0.01 vsDMSOgroup.

图318α-GA对BMSCs增殖能力的影响

表1流式细胞术检测BMSCs细胞周期分布

Table1.ThecellcycledistributionofBMSCsmeasuredbyflowcytometry(%.Mean±SEM. n=6)

GroupG0/G1phaseSphaseG2/MphaseEarly83.91±3.7514.64±1.942.94±0.32DMSO93.12±0.79**3.54±1.01**3.67±0.0718α-GA90.97±0.04**7.01±0.65**#2.03±1.01

**P<0.01vsearly group；#P<0.05vsDMSO group.

Figure 4.The expression of cyclin D1 and CDK4 in late-passage BMSCs after treatment with 18α-GA. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

图418α-GA对晚期BMSCs 的cyclin D1和CDK4表达水平的影响

已有研究报道随传代次数增加，晚期细胞p53、p21、p16等衰老相关蛋白表达水平上升，细胞自我更新和增殖能力丧失[1, 13-15]。Kim等[15]研究发现，在纤维软骨髓核细胞的衰老过程中，p53表达上调，而p53活性增高可促进p21的表达从而激活pRB，进而引起细胞衰老。Christian等[16]应用人类晚期B-J包皮成纤维细胞慢病毒转染GSE-22使p53失去活性后，细胞中DNA的合成以及细胞增殖上调90%左右，细胞群体倍增次数增高，证明p53失活可以逆转细胞复制性衰老。课题组研究发现应用18α-GA 干预晚期BMSCs提高蛋白酶体活性后，衰老相关蛋白p53和p21表达水平下降，细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达增高，CCK8、BrdU染色和流式细胞仪的检测结果也显示细胞增殖能力提高，S期细胞明显增多，提示18α-GA可通过抑制晚期BMSCs 细胞p53和p21表达活性，激活细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达，促进晚期BMSCs越过G1/S细胞周期转换点，恢复晚期BMSCs细胞增殖能力，改善细胞生长速度，延缓细胞衰老进程。

由此可见，18α-GA作用于晚期BMSCs，可以上调蛋白酶体活性进而延缓BMSCs的复制性衰老进程，恢复细胞活力。本研究采用化合物改善BMSCs蛋白酶体活性，此方法较基因修饰等手段更安全，并且操作简便，易于推广，为干细胞的临床应用提供实验依据。

[参考文献]

[1]Tonoki A, Kuranaga E, Tomioka T, et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process[J]. Mol Cell Biol, 2009， 29(4):1095-1106.

[2]Yew TL, Chiu FY, Tsai CC, et al. Knockdown of p21Cip1/Waf1enhances proliferation, the expression of stemness markers, and osteogenic potential in human mesenchymal stem cells[J]. Aging Cell, 2011, 10(2):349-361.

[3]Lu L, Song HF, Zhang WG, et al. Potential role of 20S proteasome in maintaining stem cell integrity of human bone marrow stromal cells in prolonged culture expansion [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 422(1):121-127.

[4]Lu L, Song HF, Wei JL, et al. Ameliorating replicative senescence of human bone marrow stromal cells by PSMB5 overexpression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 443(4):1182-1188.

[5]Davidson JS, Baumgarten IM. Glycyrrhetinic acid derivatives: a novel class of inhibitors of gap-junctional intercellular communication[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1988, 246(3):1104-1107.

[6]Contreras JE, Sánchez HA, Eugenin EA, et al. Metabolic inhibition induces opening of unapposed connexin 43 gap junction hemichannels and reduces gap junctional communication in cortical astrocytes in culture[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(1):495-500.

[7]Narges B, Mohammad HK, Zahra A. Phenotypic and functional maturation of murine dendritic cells induced by 18 alpha- and beta-glycyrrhetinic acid[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2014, 36(1):52-60.

[8]Rossi T, Castelli M, Zandomeneghi G, et al. Selectivity of action of glycyrrhizin derivatives on the growth of MCF-7 and HEP-2 cells[J]. Anticancer Res, 2003, 23(5A):3813-3818.

[9]Kapeta S, Chondrogianni N, Gonos ES. Nuclear erythroid factor 2-mediated proteasome activation delays senescence in human fibroblasts[J]. J Biol Chem, 2010, 285(11):8171-8184.

[10]Chondrogianni N, Stratford FL, Trougakos IP, et al. Central role of the proteasome in senescence and survival of human fibroblasts: induction of a senescence-like phenotype upon its inhibition and resistance to stress upon its activation[J]. J Biol Chem, 2003, 278(30):28026-28037.

[11]Arslan MA, Chikina M, Csermely P, et al. Misfolded proteins inhibit proliferation and promote stress-induced death in SV40-transformed mammalian cells[J]. FASEB J, 2012, 26(2):766-777.

[12]赵云鹤, 张卫国, 朱茜, 等. 蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区神经干细胞增殖潜能的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(9):1704-1707.

[13]Banfi A, Muraglia A, Dozin B, et al. Proliferation kine-tics and differentiation potential ofexvivoexpanded human bone marrow stromal cells: implications for their use in cell therapy[J]. Exp Hematol, 2000, 28(6):707-715.

[14]Mareschi K, Ferrero I, Rustichelli D, et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow[J]. J Cell Biochem, 2006, 97(4): 744-754.

[15]Kim KW， Ha KY， Lee JS, et al. Senescence of nucleus pulposus chondrocytes in human intervertebral discs[J]. Asian Spine J, 2008, 2(1):1-8.

[16]Beauséjour CM, Krtolica A, Galimi F, et al. Reversal of human cellular senescence: roles of the p53 and p16 pathways[J]. EMBO J, 2003, 22(16): 4212-4222.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

*[基金项目]广东省医学科研基金立项课题(No. B2012195)；国家中医药管理局三级实验室病理生理实验室开放基金资助项目(No. 2011ZD004)

Upregulationofproteasomeactivityby18α-GApromotesproliferationoflate-passageBMSCsin vitroYANGJia-chao,ZHAOYun-he,JIANGRong,LULi

(Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China. E-mail: luli7300@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of 18 alpha-glycyrrhetinic acid (18α-GA) on delaying the senescent progress and promoting the proliferation in late-passage bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: Late-passage BMSCs were incubated with 2.0 mg /L 18α-GA or the same volume of DMSO for 30 d, and the cells were harvested to determine the proteasome activity. The expression of senescence-related proteins p53, p21 and p16 was detected by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining and Western blot. The cell proliferation, the expression level of cell cycle-related proteins and cell cycle distribution of the cells were measured by CCK-8 assay, BrdU incorporation, Western blot and flow cytometry. RESULTS: Compared with DMSO group, the proteasome activity in 18α-GA group increased significantly by about 0.2 times (P<0.01). SA-β-Gal-positive cells in 18α-GA group decreased, and cell staining was lighter. The contents of p53 and p21 in 18α-GA group were decreased (P<0.05). The results of CCK-8 assay showed that the A value in 18α-GA group was 0.3 times higher than that in DMSO group (P<0.01). BrdU incorporation showed the increased proliferation in 18α-GA group compared with DMSO group (P<0.05). The cells in G1phase in 18α-GA group decreased significantly compared with DMSO group, while the cells in S phase increased significantly (P<0.05). The expression level of cyclin D1 in 18α-GA group was 2.8 times higher than that in DMSO group (P<0.01), and the CDK4 level was 1.4 times higher than that in DMSO group (P<0.05). CONCLUSION: Activation of the proteasome activity by 18α-GA delays the aging process in the BMSCs and promotes the cell proliferation via up-regulation of the cell cycle-related proteins.

[KEY WORDS]18α-Glycyrrhetinic acid; Proteasome; Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell proliferation

通讯作者△Tel: 020-38688909; E-mail: tzhuker@jnu.edu.cn

[收稿日期]2015- 09- 06[修回日期] 2015- 10- 30

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2188- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.012

[中图分类号]R363

[文献标志码]A