系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞衰老的研究进展

王智琴 彭学标

510515广州，南方医科大学南方医院皮肤科

系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞衰老的研究进展

王智琴 彭学标

510515广州，南方医科大学南方医院皮肤科

系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多器官、多系统的临床表现多样的慢性自身免疫性疾病。骨髓间充质干细胞（BMSC）是一类中胚层来源的非造血干细胞，是造血微环境的重要成分。多项研究表明，SLE是一种干细胞疾病，不仅造血干细胞存在异常，间充质细胞（MSC）也存在异常，具体表现为：生物学特征改变、细胞骨架及超微结构异常、端粒缩短、端粒酶及SA-β-Gal活性增强、分化能力减弱、免疫调节功能异常等衰老特征；其衰老机制可能与MSC内p53/p21cip1、p16INK4a/Rb、p27kip1/pTEN表达上调、ROS水平升高、内质网应激、表观遗传学改变等有关。

红斑狼疮，系统性；间质干细胞；衰老；造血干细胞；端粒；后成说，遗传

系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多器官、临床表现多样的自身免疫性疾病，T、B淋巴细胞异常活化，炎症因子、自身抗体过量产生在SLE疾病的发病中发挥重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类中胚层来源的非造血干细胞，是造血微环境的重要成分，具有高度自我更新、体外高度扩增、多向分化、支持造血、免疫调节及诱导免疫耐受能力、免疫原性弱、组织修复再造等特点。许多学者认为SLE是一种干细胞疾病，现就SLE的MSC衰老特征及可能的衰老机制概述如下。

一、MSC的生物学功能

MSC功能：①支持造血：MSC可通过分泌细胞因子，与造血干细胞直接接触等方式调节造血干细胞增殖更新、以及分化为成熟的血细胞；②免疫原性弱：MSC不表达MHC-Ⅱ、HLA-DR和表达少量的MHC-Ⅰ，这种特点使其不激活CD4+细胞，逃过异体抗原识别；③免疫调节：MSC可通过细胞间的直接接触和释放可溶性细胞因子调节免疫细胞功能；④组织修复再造：在局部微环境的诱导下，无需诱导剂，较明显地集中于受损伤部位，并向损伤修复所需的组织细胞分化。Shi等［1］发现，将MSC静脉注射到狼疮鼠体内，24 h后能归巢到各脏器，包括肺、肾、脾、心、淋巴结，但主要在肾、肺。

二、MSC衰老的特征

MSC衰老表现［2］：①细胞增殖缓慢，细胞集落数量下降、集落变小；②细胞体积增大，肌动蛋白应力纤维重排、过度聚集，超微结构改变；③端粒缩短、端粒酶活性增强；④衰老相关的β半乳糖苷酶活性增加、细胞迁移能力减弱；⑤分化潜能显著下降；⑥多种细胞因子分泌异常及免疫调节能力异常；⑦MSC出现明显的不可逆G1期阻滞，细胞凋亡增多；⑧内质网氧化应激系统激活、以及细胞内活性氧水平升高；⑨调节细胞生物学行为相关基因的表达变化，如，生长调控蛋白（p53、p21、p16等）异常表达；⑩细胞衰老相关表观遗传学改变。

三、SLE患者的MSC

1．SLE患者的MSC生物学特征：SLE患者的MSC有早衰迹象［3-5］，MSC体外生长较正常人缓慢，体积增大，易衰老，且贴壁紧密，胰酶消化时间延长且不易消化，传代过程中活力逐渐丧失，倍增时间更长。Nie等［4］报道，SLE患者MSC较正常MSC生长速率更慢，增殖能力弱，传代至第3代后大而扁，4代之后细胞不能融合；但MSC表面免疫标记无差异。Sun等［3］发现，SLE患者BM-MSC体外仅能传代10代左右（正常人25～40代）；但SLE患者染色质核型正常。

2．SLE的MSC超微结构明显出现了衰老的征象［6］：SLE的MSC内见大量自噬体，细胞核不规则，常染色质丰富，异染色质少见，胞质内质网肿胀，足突形成；细胞骨架F肌动蛋白排列紊乱，应力纤维失去沿细胞极性，且在某些部位浓聚成团即过度聚合现象；纽蛋白在细胞边缘排列紊乱，细胞核周围增多。在体外培养过程中，MSC内活性氧水平随着传代的代数而升高。Shi等［1］发现，SLE患者的BM-MSC内活性氧水平较正常高，F肌动蛋白高度聚集，细胞的迁移归巢减弱，提示可能导致细胞骨架改变，细胞归巢迁移运动受阻，组织修复再造能力降低。此外，孟德芳等［7］和 Li等［5］发现，SLE 患者MSC内SOD水平降低，活性氧水平升高；P13K/AKT/p-Fox03信号通路活化，转录因子Fox03磷酸化。提示在SLE患者BM-MSC细胞中，高水平活性氧可能促进细胞衰老，P13K/AKT/p-Fox03信号通路发挥重要作用。

3.SLE患者的MSC细胞端粒以及端粒酶活性的改变：端粒酶是一种核酸核蛋白酶，由RNA，反转录酶，结合蛋白组成，能以自身的RNA为模板在染色体末端合成端粒重复序列，以维持端粒长度，减缓细胞衰老。大多数体细胞检测不到其活性，端粒酶活性主要在干细胞及大多数肿瘤细胞中检测到［8］。端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞周期的稳定性、细胞增殖分化、凋亡、衰老［9］。有报道［10］MSC 转染了端粒酶后，MSC 寿命延长，分化能力增强。Nie 等［4］和 Kurosaka 等［11］报道，SLE患者的MSC端粒酶高表达，与疾病活动指数相关，可能触发了狼疮MSC早衰机制，参与SLE的发病。有学者认为，细胞染色体末端端粒缩短将激活p53、启动DNA损伤、细胞周期停滞。但目前端粒长度的缩短导致细胞分裂停止的机制尚不完全清楚，

4.SLE患者MSC的衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性：β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）是体内外细胞衰老的标志酶，研究发现，正常人的hUC-MSC随着传代次数的增多，SA-β-Gal阳性细胞比例不断增加；正常人和SLE患者BMMSC在体外培养均有衰老现象：细胞内SA-β-Gal呈阳性，但是SLE患者的BM-MSC的SA-β-Gal活性以及SAβ-Gal阳性的BMSC比率及较正常人高［5］。

5.SLE患者MSC的分化能力存在异常：细胞衰老的MSC特征之一为分化能力下降。SLE的BM-MSC向脂肪分化能力下降，脂蛋白酶（LPL）mRNA表达水平低；此外，形成钙结节少，其细胞表面Runt相关转录因子2/核心结合因子（Runx2/CBFAl）、降钙素 mRNA 表达水平低。Tang 等［12］研究发现，SLE的BM-MSC中核转录因子NF-kβ过度活化，通过BMP/Smad信号通路，抑制BMP-2促成骨作用，导致SLE患者的BMMSC成骨分化能力明显降低，最终出现骨质疏松等症状。Ross等［13］报道，老年人骨质疏松可能是由于MSC分化为成骨细胞的能力下降而导致，由此，推测SLE患者存在骨代谢异常表现为全身性骨质疏松，除与糖皮质激素的长期应用有关，可能也与MSC向成骨细胞诱导分化的能力下降有关。

6.SLE患者MSC免疫调节及细胞因子分泌异常：SLE的MSC 的免疫调节能力较正常 MSC 降低［14］。Nie 等［4］报道，在PHA刺激条件下，SLE与正常人的MSC均与自体T细胞共培养，发现SLE患者MSC对T细胞增殖的抑制作用较正常人明显低。SLE患者的MSC调节细胞因子分泌异常：Th1细胞因子（INF-γ、TNF-a、IL-2） 较正常偏低，Th2 细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）水平较正常人高；其中血清IL-10、TNF-a水平与SLEDAI呈正相关。

四、SLE的MSC衰老的机制

细胞衰老机制的假说：①复制性衰老-端粒缩短；②细胞周期蛋白的表达失衡；③氧化应激；④衰老的表观调控；⑤线粒体损伤。

1.SLE患者的MSC细胞衰老相关蛋白基因的表达变化：MSC衰老的调节机制主要包括p53/p21cip1、p16INK4a/Rb、p27kip1/pTEN等调节机制。体外研究发现，随着培养代数增加，BM-MSC细胞体积增大，SA-β-Gal活性增加，呈现衰老征象，同时p16INK4a、p53、p21Cpi1、p27等细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）高表达。Gu 等［15-16］、Tan 等［17］及 Shibata 等［18］先后发现 SLE患者的 MSC内 p16INK4a、p53/p21cip、p27kip1/pTEN表达均明显增高，p16INK4a的下游基因如，p-Rb表达降低，BM-MSC呈现显著的周期抑制，细胞停滞在G0/G1期。用siRNA技术分别干预SLE患者 BM-MSC的p21cip1、p16INK4、pTEN的表达，均发现BM-MSC细胞增殖增强、SA-β-Gal活性降低，逆转SLE患者BM-MSC的衰老特征。此外，Gu等［19］还发现 SLE 患者 β 连环蛋白、p53、p21 蛋白水平较正常高，GSK-3β蛋白水平较正常降低；且沉默β连环蛋白表达后，BM-MSC的衰老特征可部分逆转；提示过度活化的wnt/β连环蛋白信号通路可能是通过p53/p21高表达，从而参与介导SLE的BM-MSC细胞衰老过程。

2.内质网应激参与SLE的BM-MSC的衰老过程：内质网应激激活的信号通路主要为：未折叠蛋白反应UPR，是一种细胞对抗内质网应激的自身保护机制。目前研究认为，UPR机制主要有：①减弱翻译能力，减少新蛋白合成，防止未折叠蛋白进一步积聚；②上调内质网分子伴侣等保护性基因的表达，包括内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94；③诱导细胞凋亡。Gu等［20］发现，内质网形态发生改变：扩张、肿胀、扭曲变形；GI期阻滞；且BM-MSC高表达P27以及内质网伴侣蛋白GRP78，低表达SKP2（类似泛素连接酶，参与p27的降解）；提示SLE患者BM-MSC内P27-SKP2在内质网应激介导的细胞衰老中发挥作用。

3.SLE患者的MSC细胞凋亡信号转导通路异常：细胞凋亡信号转导通路主要包括3种：内源性途径、外源性途径以及内质网途径。研究发现，SLE患者MSC细胞质内的细胞色素C增多，参与内源性细胞凋亡途径［5］。细胞内Fas及FasL，TNFR-α1，TNF-α在蛋白水平表达明显上调，参与外源性凋亡途径；以及凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Caspase8在mRNA水平上调，促进细胞凋亡。

4.SLE患者的MSC细胞衰老相关表观遗传学改变：表观遗传修饰是指DNA序列不发生变化，而基因的表达却发生了可遗传的改变，其中DNA甲基化是最主要的一种形式。在正常状态下，重要基因如DNA修复基因（如MGMT、p16）、DNA转录基因或抑癌基因等为非甲基化，而当其发生甲基化时，基因部分功能丧失，CpG甲基化与转录活性呈反比，致细胞DNA损伤不能被修复及增殖能力减弱。在hUC-MSC扩增传代的前期MGMT基因未出现甲基化；当细胞传至后期时MGMT基因出现了甲基化，MGMT蛋白表达几乎缺失；而hUC-MSC内的P16基因培养全程未出现甲基化。提示MGMT甲基化可能参与MSC衰老过程。T细胞的甲基化水平对基因表达有调节作用以及脱甲基的T细胞（或甲基化有缺陷的T细胞）可激活巨噬细胞从而引发T细胞凋亡，自身抗原释放，B细胞过度活化产生抗核抗体、抗DNA抗体等，导致SLE在内的自身免疫性疾病的发生［21］。SLE患者的MSC细胞内的甲基化水平如何，尚待进一步研究。

五、尝试MSC移植治疗SLE

SLE的传统治疗为糖皮质激素、免疫抑制等药物，由于长期使用不良反应大，部分难治性SLE效果不佳。目前，难治性顽固性SLE患者可行同种异体MSC移植。Ikehara等［22］报道，在异基因（供体为孙猴）造血干细胞和骨髓MSC共移植治疗狼疮鼠，生存期超过2年，且小鼠未发生移植物排斥反应。Sun等［23］报道，同种异体MSC移植治疗4例CTX/GC抵抗的难治性SLE，发现可逆转患者的多器官功能紊乱，改善肾功能，降低血清抗体滴度以及重建MSC向成骨分化能力从而改善骨质疏松。Carrion等［24］报道，自体骨髓MSC移植治疗2例SLE效果却不理想，提示SLE的MSC存在缺陷。由于MSC比起HSC免疫原性低，不容易产生排斥反应，Baxter等［25］证实了MSC可预防以及治疗移植物抗宿主疾病。美国食品药品监督管理局批准MSC近60项临床试验，自身免疫性疾病就是其中之一。目前有关MSC移植治疗SLE逐渐成为热点。

六、展望

SLE的MSC存在早衰特征，为临床寻找SLE的基因治疗和细胞治疗提供新的靶点，有深远意义。其衰老机制可能与间充质细胞内活性氧水平升高、p53/p21cip1、p16INK4a/Rb、p27kip1/pTEN等衰老相关基因表达异常，内质网氧化应激及表观遗传学改变有关。那么p53/p21cip1、p16INK4a/Rb、p27kip1/pTEN三种衰老调节机制是否相同？是其中一种或两种起主要作用？以及三者是否存在相互协调作用？以及BMMSC细胞内线粒体损伤情况？这些问题尚待进一步研究。

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（本文编辑：吴晓初）

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Senescence of bone marrow mesenchymal stem cells in patients with systemic lupus erythematosus

Wang Zhiqin,Peng Xuebiao
Department of Dermatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Systemic lupus erythematosus （SLE）is a chronic autoimmune disease characterized by multi-organ and multisystemic involvement and various clinical manifestations.Bone marrow mesenchymal stem cells （BM-MSCs）,a kind of non-hematopoietic stem cells originating from the mesoderm,are key components of hematopoietic microenvironment.Recent studies have indicated that SLE is a disorder of stem cells.Both hematopoietic and mesenchymal stem cells （MSCs）are abnormal in SLE,which mainly manifests as changes of biological characteristics,abnormal cytoskeleton and ultrastructure,shortened telomeres,increased telomerase and SA-β-Gal acitivity,decreased differentiative ability,aberrant immunoregulatory effect,and other features of senescence.The mechanism of MSC aging may be related to up-regulated expressions of aging-related genes p53/p21cip1,p16INK4a/Rb and p27kip1/pTEN,elevated levels of reactive oxygen species（ROS),endoplasmic reticulum stress,epigenetic alterations,etc.

Lupus erythematosus,systemic;Mesenchymal stem cells;Aging;Hematopoietic stem cells;Telomere;Epigenesis,genetic

Peng Xuebiao,Email:pengxuebiao@126.com

2015-04-27）

彭学标，Email：pengxuebiao@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.024

广东省自然科学基金（2014A030313317）

Fund program:Natural Science Foundation of Guangdong Province of China（2014A030313317）