异氟烷对心肌细胞血管内皮生长因子表达的影响

刘志刚 刘永芳 罗涛 陈雪君 夏中元 陈向东

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是临床上各种疾病、休克、创伤及体外循环心血管手术等病理过程中常见的损伤，由多种细胞内信号途径参与并介导。研究发现，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与心肌缺血再灌注损伤具有密切关系，对缺血心肌具有保护效应[1]。吸入麻醉药预适应可通过调节某些离子通道的开放以及促进某些蛋白激酶的活化而对心肌细胞起保护作用。其中蛋白激酶C(PKC)家族是介导预适应保护作用的重要途径，机制尚不明确。本实验通过观察临床麻醉常用吸入性麻醉药异氟烷对培养大鼠心肌细胞VEGF分泌及PKC蛋白表达的影响，探讨异氟烷心肌保护的分子机制。

材料与方法

1.主要试剂与药品：PKC抑制剂Calphostin C(Sigma，美国)，5′-溴脱氧尿苷(Sigma，美国)，异氟烷(Abbott，美国)，高糖 DMEM培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(Hyclone，美国)，兔抗鼠 PKCα、PKCδ、PKCζ和 PKCε抗体(Santa Cruz，美国)，羊抗兔 IgG(Santa Cruz，美国)，VEGF酶联免疫试剂盒(R＆D Systems，美国)，其他试剂均为Sigma公司产品。

2.心肌细胞分离培养：取1～3d SD新生大鼠，雌雄不拘，参照既往文献方法略作改良分离培养心肌细胞[2]。无菌条件下开胸取出心室肌，清洗后加入0.05％胶原酶、0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液，分次消化、离心，以15％胎牛血清的高糖DMEM悬浮细胞，差速贴壁法去除成纤维细胞。收集心肌细胞将浓度调整为5×105cells/ml之后均匀接种，置CO2培养箱(5％CO2，37℃)中培养。培养的前2d加入5-溴脱氧嘧啶0.1mmol/L，抑制非心肌细胞贴壁生长。

3.实验分组：心肌细胞随机分为：对照组，细胞不经任何处理；异氟烷组，将细胞培养皿置入一设有通气……