黄腐酸抗氧化作用机制研究进展

宋游行　李宝才　张惠芬　何　静

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南　昆明　650500)

黄腐酸抗氧化作用机制研究进展

宋游行李宝才张惠芬1何静

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500)

〔关键词〕黄腐酸；抗氧化；自由基

研究表明，人体内的氧化损伤与多种疾病如肿瘤、心脑血管疾病、机体衰老等的发生密切相关〔1〕。人体内自由基主要包括氧自由基(OFR)，过氧化脂质(LPO)和脂类自由基，其对机体造成的损伤是体内氧化作用的结果，对生物大分子和膜结构均有不同方式的损伤作用。向系统内补充抗氧化剂，清除过多的自由基或终止体内自由基反应，可防止线粒体肿胀，抑制膜的脂质过氧化反应、蛋白质交联等作用，对于保护生物膜结构与功能完整性，抑制自由基诱发的疾病或增强体质和治疗疾病都是有意义的。因此，研究开发新型高效、绿色环保的天然抗氧化剂刻不容缓。黄腐酸(FA)是自然界广泛存在的一类从泥炭、褐煤、风化煤等提取的活性产物，氧化程度高，含羧基、羟基、酚羟基、醌基等多种活性官能团，极易被人体吸收利用，是医疗效果最好的腐植酸。早在几千年前，李时珍在《本草纲目》中已有类似腐植酸药用的记载，主要用以治疗鼻子出血、妇女气血痛及诸疮毒、金疮出血等疾病〔2〕。近年来，部分研究报道了FA及其钠盐在消炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗溃疡等方面的显著疗效，且其抗氧化作用可能是发挥相关重要的生理功效的药理基础〔3〕。因此，对FA抗氧化作用机制的研究今后可能将成为其基础研究的重点之一。目前，对不同产地FA抗氧化作用的研究以证明其具备抗氧化性为多，也有一些研究涉及分析其结构与抗氧化性的关系，但对FA抗氧化作用实现的途径及其作用机制的研究报道较少〔4〕。本文结合体内主要氧化产物自由基的产生途径，从抑制体内氧化物产生与清除已有氧化物的角度，综述近年来国内外有关FA抗氧化作用机制的研究工作，为FA抗氧化作用机制的研究提供一定思路。

1自由基的产生

自由基，化学上也称“游离基”，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。正常机体的氧化损伤和抗氧化体系处于动态平衡，机体正常代谢产生的活性氧自由基能不断地被抗氧化体系清除，以维持细胞氧化和还原稳态。而人体可能由于受到外界刺激，使机体产生应激反应，也可产生自由基，打破动态平衡，损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应〔5〕。据国内外相关报道，人体可产生各种各样的活性自由基。自由基是人体脂质过氧化和损伤的直接凶手，其中衰老、肿瘤产生、心脑血管疾病等60多种疾病与自由基产生密切相关。

具体而言，人体内自由基的产生有内源性和外源性两种途径。例如化学诱导、环境污染、吸烟、微波震荡等外界因素都会使人体内产生外源性自由基〔6〕。而内源性自由基的产生则不然，主要源于机体自身代谢和酶促反应，例如线粒体中电子传导系统、线粒体肿胀、线粒体脂质过氧化过程等引起。人体在呼吸代谢中需要能量，而适量的自由基则不断传递着能量，保持呼吸代谢正常运转。

2FA的抗氧化作用机制研究

FA可能通过不同途径抑制或清除氧化损伤机体的自由基，从而发挥其抗氧化作用，但目前对FA抗氧化作用实现的途径及其作用机制的研究报道较少。

2.1FA化学结构决定其具有抗氧化作用FA是一类从泥炭、褐煤、风化煤等提取的活性产物,氧化程度高，含羧基、羟基、酚羟基、醌基等多种活性官能团。FA中的氧68%～91%存在于官能团上，最重要的官能团是总酸性基团和醌基，这些基团决定了FA的化学性质和生物活性。

FA自身的多酚-醌基结构和芳香共轭体系对自由基具有清除作用。其在某些情况下是电子接受体，表现为氧化剂，而在有些情况下则是电子给予体，表现为还原剂，这证实了FA本身就是一个氧化-还原体系，存在醌基-半醌-酚基的转换、硝基、酚羟基等的各种转换〔7〕。在这种转换的过程中，struyk提出“自生电子传递中间体”的假说。而这种氧化-还原体系在体内必然会参与到生理和能量代谢中。Nardi等〔8〕认为，FA进入植物体主要作为氢的受体影响植物的氧化还原，促进植物体内糖的积累，特别是在缺少氧的条件下，可以促进ATP的积累合成，或者为多酚供应源，起呼吸催化剂的作用。Aiken等〔9〕提出，FA的芳香共轭体系，顺磁水平(自由基浓度)与生理药理活性呈现正相关，并建议用自由基的浓度作为评价FA生理药理活性的重要指标。可见，FA的结构组成与其生理药理活性密切相关，可能是其抗氧化机制之一。

2.2FA对相关酶和激素活性的影响有报道认为，FA的药理作用实际就是激素的作用。动植物自身的体内激素有上百种之多，而FA是由微生物的代谢产生，所以FA中也有几十种激素，他们有的是和FA以化学或者物理键结合，有的可能本来就是FA组成中的一份子，不过是存在形式不一样而已。

也有部分报道认为，FA是酶的激活剂或者抑制剂，大致包括以下几种：(1)抑制透明质酸酶，与抗感染和减少炎症渗出有关；(2)抑制红细胞中三磷酸腺苷酶，以调节基础代谢；(3)抑制胆碱酯酶，与减缓疼痛相关；(4)激活己糖激酶，促进糖氧化磷酸化和糖代谢；(5)激活凝血酶，或诱导纤维蛋白溶解酶原激活剂(t-PA)释放,这与凝血止血有关；(6)活化植物体内的合成酶(主要为醛羧酶和转化酶)，促进可溶性碳水化合物积累，让细胞渗透压改变。此外，FA还对过氧歧化酶、过氧化氢酶、脂合酶等都有活化或抑制作用〔10〕。

2.3FA的金属离子络合作用众所周知，自由基的另一重要来源是机体内过渡金属离子。绝大多数过渡金属离子都含有未配对的电子，它们可以催化机体产生自由基，对机体造成氧化损伤。而FA对金属离子具有一定的络合作用，从而可以很大程度地抑制自由基产生。FA的羧基、酚羟基以及很多含O、P、N、S等的基团都是电子给予体，所以是一类天然的络合剂或者螯合剂，较容易与金属离子配位。因至今很难分辨到底哪些是螯合，哪些是络合，故统称为络合反应。

王将等〔11〕利用电子自旋共振(ESR)波谱技术，分析铁离子影响下杏仁皮中黄酮类化合物抗自由基的效应。结果证明：杏仁皮中黄酮类化合物对铁影响下自由基诱发的红细胞膜过氧化有一定保护作用。分析其机制，一是杏仁皮中黄酮类化合物对铁的络合作用，减弱了铁的活性而抑制自由基的过渡产生；二是对膜脂质过氧化启动因子·OH的高效清除及对次级产生的脂自由基的清除，从而抑制脂质过氧化链的启动与增长。而李宝才等〔12〕则认为茶褐素和黄腐酸具有相似的结构和官能团，由此生理药理活性相近。Gao等〔13〕研究茶多酚对铁诱导的突触小体脂质过氧化的保护作用，结果表明，茶多酚的抗氧化作用不仅与其清除自由基有关，而且也与其络合铁离子的能力密切相关。有学者的实验证明，茶黄素是通过与铜离子及铁离子的络合而降低细胞中低密度脂蛋白(LDL)的氧化程度，并抑制体内Fenton反应，从而起到抑制活性氧自由基产生的作用。

FA的络合能力很强，虽然不知道具体的络合形式和配位数，但其对自由基产生和消除有影响是毋庸置疑的。据报道，X光电子能谱(XPS)可以鉴别元素的种类和化合价态、测定元素相对含量，了解中心原子与配位原子的相互作用，可能是研究电荷转移络合物最有利的手段之一。如有学者〔14〕利用XPS研究发现，FA-La的O1S结合能比FA-K高，对自由基的抑制程度可能就会更高。

2.4FA抑制脂质过氧化反应脂质过氧化是一种自由基链式反应，可反复进行，并伴随有大量中间产物产生(如：O2、H2O2、·OH等自由基和过氧化物)；损害细胞膜结构和功能，同时其中间产物及终产物丙二醛(MDA)对细胞也具毒性。脂质过氧化过程中发生ROS氧化生物膜的过程，即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成LPO，如MDA和4-羟基壬烯酸(HNE)，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变〔15〕。

机体内的自由基可以攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，并引发脂质自由基过氧化链式反应。FA可与脂质链式的中间产物脂氧自由基反应，从而终止链反应，抑制脂质过氧化。曾述之〔16〕研究表明，北京风化煤黄腐酸钠对体内不饱和脂肪酸氧化抑制率达到92.7%，对应激红细胞过氧化(生成MDA)抑制率92.4%，对·OH 诱导溶血A540抑制率73.2%，对红细胞释放抑制率和红细胞膜胆碱酯酶(AchE)的灭活抑制率均增加了1倍左右。王伟等〔17〕研究发现，大骨节病(KBD)病人体内存在脂质过氧化和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力降低，由此，FA的自由基清除机制在保护生物膜成分和组织损伤的临床应用中得到初步证实。

2.5FA激活机体抗氧化体系机体自身的抗氧化体系分为酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统。体内的抗氧化酶系统主要有超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px以及过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化酶(CCO)等，这些酶可以抵抗自由基，防止衰老，保护生物体免疫损伤，因此也称为防御酶〔18〕。非酶系统则包括维生素A、维生素E、维生素C等。

Frimmel等〔19〕的研究报道，FA的施加可以影响植物的氧化过程，促进氧的吸收，提高生理代谢能力和酶的活力。Rezacova等〔18〕认为，FA螯合金属离子影响植物细胞膜通透性和膜上载体的性质，增加ATP酶的活性。正是由于FA的综合刺激活性，才促使植物各种酶〔包括多酚氧化酶(FOD)、蛋白分解酶、过氧化氢酶(CAD)、过氧化物酶(POD)等〕的合成及生理活性增强。Anjum等〔20〕的研究表明，FA具有激活细胞保护酶活性，延缓衰老的作用。回振龙等〔21〕也报道称，FA可以同时提高SOD、CAD和POD等酶的活性，清除活性自由基，激发作物生命活性。

在农业上，植物体中加入FA之后也可以增加维生素C的含量，使FA对自由基的清除进一步加强，而FA本身可能也含有一些维生素类物质可以起到作用。

3研究前景展望

近年来，茶多酚、蜂胶、壳聚糖、橙皮素等许多天然抗氧化物质均得到了较好的应用，如国外天然蜂胶的生产工艺已比较成熟〔22〕,橙皮素在欧洲被广泛作为一种具有食品补充剂使用〔23〕。但抗氧化活性物质的研究及运用总体上还处在初级阶段，这也意味着对它们的研究有着广阔的前景，具有很大的潜力〔24〕。据相关资料证实，在人们经常食用的产品中，天然抗氧化剂的毒性远远低于人工合成抗氧化剂，因此，从自然界中寻找天然抗氧化剂已引起越来越多科学家的高度重视。FA具有高效的天然抗氧化活性成分，如果能对其抗氧化作用进行深入研究与开发，或许可以产生丰富的商业价值和社会价值。

而FA相关生物活性基础研究工作的难点和重点依旧是其自身的结构和稳定性问题。大量的研究数据表明,不同产地来源,甚至同一产地不同分级成分FA的生物活性作用都可能大不相同，正如Senesi等〔25〕所说：“应当先研究简单的确定了的腐植酸的化学结构和医疗效果，再推进更艰难的天然腐植酸研究” 。作为食品添加、医药实验或者临床试验的FA产品，必须在严格实验的基础上，以原料产地固定产品来源，固定生产技术工艺，并对产品质量严格控制。只有稳定的物质结构基础和稳定性，才能使FA的生物活性基础研究更加明朗。

就目前而言，不同产地FA抗氧化作用的研究以证明其具备抗氧化作用为多，但对其抗氧化作用实现的途径及其作用机制的研究报道相对较少。笔者认为，首先，在FA影响酶产生及活性方面，已知生物体中存在多达100种以上的氧化酶，而FA中也有多种类别的酶，但对两者之间相互关系的研究不多，需多开展这方面的相关研究工作。其次，在提高机体抗氧化系统功能性方面，有关FA增强机体抗氧化酶活性的研究较少，对不同性质及结构的FA对不同的抗氧化酶活性影响的规律尚缺乏认识。再次，FA的抗氧化性与其组分、结构或聚合度都有密切关系，目前这方面的研究尚需要进一步探究。最后，和已研究成熟的天然抗氧化剂相比较，在分子水平层面，应对FA是否可以提高抗氧化酶m-RNA转录水平的表达量，对抗氧化酶基因表达是否可以呈现相关的调节作用来研究；而在细胞水平层面，则应该建立可行的细胞损伤模型和动物损伤模型对其进行深入的探讨；同时，还应加强对FA发挥抗氧化作用的内源性分子靶点的研究，以找到问题的本质〔26〕。上述方面必将成为今后黄腐酸抗氧化作用机制研究的重要发展方向。

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〔2015-10-10修回〕

(编辑曲莉)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21166013)

〔中图分类号〕R2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2532-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.106

1昆明理工大学云南省食品安全研究院

第一作者：宋游行(1989-)，男，在读硕士，主要从事腐植酸医药应用研究。