结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及相关耐药性分析

赵淑杰 韩利军 赵振国

结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及相关耐药性分析

赵淑杰 韩利军 赵振国

目的 分析结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及相关耐药性。方法 收集本市的120株结核分枝杆菌分离株，使用Spoligotyping法和PCR法进行基因分型，并予以药敏检测。结果 120株结核分枝杆菌以北京家族为主，在北京家族中以现代型为主。北京家族菌株现代型和古代型的耐药性相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 本地区的结核分枝杆菌具有基因多态性，主要基因型为北京家族，北京家族菌株与非北京家族菌株的耐药性差异无统计学意义。

结核；分枝杆菌；基因分型；耐药性

随着抗生素的广泛应用，结核分枝杆菌的耐药性不断增加，对人类健康造成了严重的威胁［1-2］。本次分析本院收集的120株结核分枝杆菌临床分离株，对其进行基因分型研究和耐药性分析，结果如下。

1　材料与方法

1.1标本来源及资料

120株结核分枝杆菌临床分离株均来自本院的120例结核病患者，其中男75例，女45例，年龄18～78岁，平均年龄（50.3±2.5）岁。H37Rv标准株由中国疾病预防控制中心传染病所提供。

1.2试剂

2×PCR混合体系（无锡博慧斯生物医药科技有限公司），DNA分子标记、L-J药敏培养基（珠海贝索生物技术有限公司），Biodyne C膜（美国Biosupport公司）、链霉亲和素过氧化物酶和CDP-star（美国CE公司）。

1.3方法

1.3.1Spoligotyping分 型 （1）CNA提取：用 生 理 盐水将结核分枝杆菌从培养基洗脱，予以80℃孵育30 min灭活，沸水煮30 min，离心半径设置10 cm，12 000 r/min离心3 min，取上清为DNA模板，零下20℃保存备用。（2）PCP扩增：引物DRa和DRb扩增结核分枝杆菌DR区。DRa：5'-GGTTTTGGGTCTGACGAC3'，5'端进行生物素标记；DRb：5'-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3'。PCP反应条件：96℃3 min；96℃ 1 min；55℃ 1 min，72℃ 30 s，35个循环延伸6 min。扩增H37Rv结核分枝杆菌和卡介苗为对照。PCP产物与Biodyne C膜杂交。通过链霉亲和素过氧化物酶进行孵育、CDP-star检测，X线曝光结果。

1.3.2NTF分型 以北京家族为模板，使用MDR-6、MDR-6r正反向引物进行扩增，1.5%琼脂凝糖胶电泳检测扩增产物，凝胶成像仪分析，PCR产物片段大小，现代型表现为1 500 bp，古代型表现为302 bp。

1.3.3药敏实验和菌种定义 按照结核病诊断细菌学检验规程进行菌群鉴定［3］，药敏实验按照比例法进行操作，分别将菌群接种在异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素的培养基上（药物浓度按照绝对浓度法）。

1.4数据分析

使用SPSS 18.0软件分析包对所得数据进行分析，以（%）表示计数资料、采用χ2检验， （x-±s）表示计量资料，采用 t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2　结果

2.1菌株基因组成

120株结核分枝杆菌分离株北京家族80株（66.7%），非北京家族40株（33.3%）；18株（15.0%）为独立型，102株为成簇型（85.0%）；在北京家族的菌株中现代型52株（65.0%），古代型28株（35.0%），非北京家族菌株中T基因型28株（70.0%），非T基因型12株（30.0%）。

2.2北京家族菌株的耐药性分析

北京家族的现代型菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的耐心药性分别为7.7%（4/52），9.6%（5/52），9.6%（5/52），11.5%（6/52）；北京家族的古代型菌株对以上药物的耐心药性分别为7.1%（2/28），10.7%（3/28），7.1%（2/28），14.3%（4/28）。北京家族的现代型菌株和古代型菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的耐药性相比差异无统计学意义，P＞0.05。

3　讨论

在笔者的研究中，本院的120株结核分枝杆菌分离株中主要以北京家族为主，由于多耐药性的北京型菌株多次引起爆发性的流行病，因此对于北京型菌株的耐药性研究为临床研究的重点［4］。北京家族现代型菌株的耐药性和古代型菌株的耐药性差异不显著，与宁夏、重庆等地的报道中结果相近［5-6］，而贵州地区［7］对北京家族的耐药性分析中显示古代型的耐药性高于现代型差异有统计学意义，笔者认为是地区差异原因。

结核病仍是主要的传染病之一，有关研究统计［8］，结核分枝杆菌感染率为33.3%左右，全球每年有300万人死于该疾病。随着我国卫生状态的改善，结核病的发病率和死亡率都大大下降，但对于结核病的防治工作仍不能松懈。

［1］ 刘芮汐，李奇志，幸琳琳，等. VNTR-MIUR和spoligotyping用于重庆地区210株儿童结核分枝杆菌临床分离株的基因分型［J］. 中华流行病学杂志，2011，32（6）：593-597.

［2］ 孙宏莉，徐英春. 结核分枝杆菌检测实验室生物安全防护要求［J］. 中国继续医学教育，2009，1（3）：74-75.

［3］ 刘桂艳，张炜煜，王博，等. RD105基因缺失法鉴定95株结核分枝杆菌北京基因型及其耐药相关性分析［J］. 中国卫生工程学，2012，11（5）：363-365.

［4］ 陈春华，刘小琴，王永忠. 结核分枝杆菌临床分离株分型及耐药性分析［J］.重庆医学，2012，41（34）：3641-3642.

［5］ 王晓平，逄宇，赵晓，等. 宁夏回族自治区结核分枝杆菌基因分型及与耐药性关系的研究［J］. 中国防痨杂志，2013，35（9）：655-659.

［6］ 汪晓艳，赵雁林，逄宇，等. 重庆市结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及相关耐药性分析［J］. 中国防痨杂志，2013，35（9）：668-672.

［7］ 孙荣，欧维正，王燕，等. 贵州省结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及耐药性分析［J］. 中国病原生物学杂志，2015，10（12）：1074-1077.

［8］ 韦珍，赵亚楠，武晓琳，等. 结核分枝杆菌临床分离株耐药性与耐药基因突变关系的研究［J］. 临床肺科杂志，2015，20（7）：1209-1212.

The Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis Clinical Isolates and Analysis of Drug Resistance

ZHAO Shujie HAN Lijun ZHAO Zhen'guo Department of Laboratory，Hospital for Infectious Diseases in Changchun City，Changchun Jilin 130000，China

Objective To analyze of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates of gene typing and their drug resistance. Methods To collect 120 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates in the city. Genotyping was performed using Spoligotyping and PCR methods，and the drug sensitivity test was performed. Results 120 strains of Mycobacterium tuberculosis were mainly in Beijing family，and the modern type was the main type in Beijing family. There was no significant difference in the resistance of the modern and ancient strains of Beijing family strains （P ＞ 0.05）. Conclusion The Mycobacterium tuberculosis in the region has the genetic polymorphism and the main genotype is the Beijing family. There was no significant difference in the drug resistance between theBeijing family and the non Beijing family.

Tuberculosis，Mycobacterium，Genotyping，Drug resistance

R440

A

1674-9316（2016）18-0146-02

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.18.096

吉林省卫生厅课题，编号（2013Z067） 作者单位：长春市传染病医院检验科，吉林 长春 130000