副结核分枝杆菌MAP0862、MAP1345基因的串联表达及其在间接ELISA中的初步应用

张振，张阁，彭永，彭小薇，孙翠丽，常维山，朱良全*，丁家波*

(1. 山东农业大学动物科技学院，山东泰安270018；2. 中国兽医药品监察所，北京100081)

副结核分枝杆菌MAP0862、MAP1345基因的串联表达及其在间接ELISA中的初步应用

张振1，2，张阁2，彭永2，彭小薇2，孙翠丽1，2，常维山1，朱良全2*，丁家波2*

(1. 山东农业大学动物科技学院，山东泰安270018；2. 中国兽医药品监察所，北京100081)

为探索副结核特异性蛋白MAP0862与MAP1345在牛副结核病血清学诊断中的作用，将通过串联表达获得的融合蛋白MAP0862-1345纯化定量后包被酶标板，经过对反应条件的优化，初步建立了基于融合蛋白MAP0862-1345的间接ELISA诊断方法。使用建立的ELISA方法对牛副结核病阳性血清、牛结核病阳性血清、牛布病阳性血清、卡介苗免疫牛血清、健康牛血清检测的结果表明其具有较好的特异性；使用该方法与IDEXX副结核病抗体检测试剂盒共同对300份临床血清样本检测，总符合率为92.7%。

副结核分枝杆菌；串联表达；间接ELISA

副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消化系统疾病，主要引起反刍动物慢性肠炎以及生产性能下降。目前该病在全世界范围内流行，尚无有效的治疗方法，最好的控制方法就是对畜群进行严格的检疫并及时淘汰阳性牛[1]。对于副结核病检疫诊断，常用方法为ELISA与皮肤变态反应。但由于副结核分枝杆菌属于禽结核分枝杆菌属的一个分支，其与其他禽结核分枝杆菌存在基因与抗原表位的交叉，如皮肤变态反应用的副结核抗原与禽结核菌素(PPD-A)、牛结核菌素(PPD-B)、环境分枝杆菌存在共同抗原[2]。因此寻找具有鉴别诊断作用的副结核分枝杆菌特异性蛋白，并以其为基础建立ELISA方法是诊断副结核病的有效途径。

关于运用副结核分枝杆菌特异性蛋白建立ELISA方法几无报道，不过目前通过比较基因组学已经鉴定出至少13个副结核特异性抗原[3]。实验室前期已原核表达获得了5个特异性蛋白，初步试验表明MAP0862与MAP1345具有一定的血清学鉴别诊断效果。目前关于副结核蛋白的研究较少，已有MAP0862蛋白的抗原性报道，然而对于MAP0862与MAP1345蛋白的结构、功能至今未有相关报道[4]。为了探索前期发现的具有较好诊断作用的两种蛋白在协同作用下的鉴别诊断中应用价值，本研究通过引入一段柔性氨基酸将副结核特异性蛋白MAP1345与MAP0862进行串联表达，并对其表达产物进行了抗原性分析，将表达产物纯化复性后作为ELISA包被抗原，进一步优化了在ELISA反应中的各项参数，为后续系统建立ELISA方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 副结核分枝杆菌菌株P18(C68678)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。原核表达载体pET-32a由本实验室保存。

1.1.2 试剂 Herrold蛋卵黄琼脂培养基购自BD公司；DNA聚合酶Q5、限制性内切酶EcoR I、XhoI、T4 DNA Ligase购自NEB公司；小量质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；胶回收试剂盒、细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、片段回收试剂盒购自Takara公司；HRP标记的兔抗牛酶标抗体购自SIGMA公司。

1.1.3 包涵体蛋白纯化溶液配制 包涵体洗涤液 1: 20 mmol/LTris，5 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100；包涵体洗液2: 20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，2 mol尿素；变性液：20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素；复性液：20 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，1%甘氨酸，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L谷胱甘肽。以上溶液配制后使用盐酸调pH值至7.4。

1.1.4 血清 牛副结核病阳性血清、牛结核病阳性血清、牛布病阳性血清、卡介苗免疫牛血清、健康阴性牛血清(副结核病、结核病及布病抗体均为阴性)，由本实验室鉴定保存。临床牛血清采集自山东某牛场。

1.2 方法

1.2.1 菌种复苏与基因组提取 无菌开启一支冻存的P18副结核菌种，用0.5 mL灭菌生理盐水将菌体重悬后接种于一支Herrold蛋卵黄琼脂培养基斜面，置于37 ℃温箱内培养21～35 d，待表面长出白色颗粒状菌苔，用5 mL灭菌生理盐水将菌体洗下后，80 ℃灭活2 h。接着将灭活菌体转移至罗氏真空磁珠管中，用组织研磨机上(1 000 r/min，10 s)将菌体充分震荡打散，然后按照Takara细菌基因组DNA小量纯化试剂盒提取革兰氏阳性菌的步骤提取P18全基因组。1.2.2 引物设计 分别从GenBank上调取MAP0862与MAP1345基因序列，使用DNASTAR软件分析两个序列中包含抗原位点的疏水性区域，使用Primer Premier 5.0软件设计针对两段基因的特异性引物。序列见表1。

1.2.3 片段扩增与目的片段回收 以副结核分枝杆菌P18基因组作为模板，使用引物P1与P2扩增MAP1345基因，使用引物P3与P4扩增MAP0862基因，反应组分为：2×Master Mix 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各2.5 μL，基因组2 μL，加灭菌ddH2O至50 μL。反应程序为：98 ℃ 30 s ; 98 ℃下划线部分为酶切位点，加粗部分为引入的柔性氨基酸序列10 s，54 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s(30个循环); 72 ℃ 10 min延伸PCR反应。PCR反应结束后使用胶回收试剂盒对两个产物进行回收。

表1 特异性引物序列

1.2.4 重叠PCR 使用分光光度计对两个PCR回收产物测定浓度后按照1∶1等量混合作为PCR反应模板，使用引物P1与P4对模板进行扩增, PCR反应程序为：98 ℃30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s， 72 ℃ 40 s(30个循环)；72 ℃ 10 min延伸PCR反应，获得MAP1345与MAP0862的融合基因。

1.2.5 重组质粒构建与诱导表达 使用限制性内切酶EcoR I、XhoI分别对融合基因MAP1345-0862与原核表达载体pET-32a进行双酶切后回收目的片段，按照一定比例将两种回收产物混合后使用T4 DNA Ligase进行连接，将连接产物转化进入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单个菌落摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定，将含阳性质粒的重组菌转接含氨苄抗性的新鲜LB培养基，以37 ℃、150 r/min摇菌4～6 h，当OD450 nm为0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续摇菌4 h后收集菌体。

1.2.6 SDS-PAGE鉴定 取诱导后菌液超声破碎(30%功率；超声2 s；暂停2 s；超声10 min)。分别取标签蛋白，全菌蛋白，超声后沉淀，超声后上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，验证目的蛋白大小以及可溶性。

1.2.7 包涵体形式目的蛋白纯化 超声破碎后的菌体经4 ℃12000 r/min离心20 min收集沉淀菌体，每克菌体使用40 mL包涵体洗液1重悬后，经4 ℃12000 r/min离心25 min 收集沉淀；沉淀用40 mL包涵体洗液2重悬，搅拌溶解1 h，经4 ℃12000 r/min离心25 min 后弃去上清；沉淀加入40 mL含8 mol/L尿素的变性液室温搅拌2 h ，4 ℃12000 r/min离心25 min；吸取上清溶液使用0.45 μm滤器过滤后装于处理后的透析袋内，然后置4 ℃依次使用含8、6、4、2、0 mol/L尿素的复性液进行透析复性。复性蛋白使用Hiprep 26/10 Desalting脱盐后置换到PBS溶液中[5]。

1.2.8 SDS-PAGE与Western Blot鉴定 分别取诱导重组菌超声后上清、超声后沉淀、纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，一块凝胶进行考马斯亮蓝染色；另一块凝胶进行Western Blot，将纯化后的目的蛋白使用伯乐凝胶转印系统转印到PVDF膜上，使用牛副结核病阳性血清作为一抗，1∶5000稀释的HRP标记的兔抗牛酶标抗体作为二抗，进行Western Blot鉴定。

1.2.9 间接ELISA条件优化以及方法的建立

1.2.9.1 使用棋盘法确定最佳抗原包被条件以及最佳血清稀释度 将纯化定量后的重组蛋白MAP0862-1345用1×碳酸盐缓冲液按照200、100、50、25 ng/mL四个稀释度进行稀释，将稀释后的重组蛋白按每孔100 μL加入酶标板后于4 ℃包被过夜，使用PBST缓冲液洗板三次；每孔加入100 μL含5%脱脂奶粉的PBST 溶液于37 ℃封闭2 h后，使用PBST缓冲液洗板三次。将阴阳性对照血清按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200四个稀释度进行稀释后以每孔100 μL加入酶标板中，37 ℃作用30 min，PBST溶液洗板三次；每孔加入100 μL1∶10000稀释的HRP标记的兔抗牛酶标抗体，37 ℃作用30 min，使用PBST溶液洗板三次；每孔加入100 μL TMB显色液室温避光显色15 min，然后每孔加入50 μL 1 mol/L HCL终止反应，测定OD450 nm值，以阳性血清与阴性血清的最适OD450 nm比值(P/N)所对应的抗原包被浓度与血清稀释度作为最佳浓度。

1.2.9.2 最佳封闭条件的确立 在确定最佳抗原包被浓度与血清稀释度后，分别使用含5%脱脂奶粉、5%马血清、5%明胶的PBST溶液作为封闭液，进一步优化ELISA参数，以背景值最低的封闭液作为最佳封闭液。

1.2.9.3最佳酶标抗体浓度的确立 按照优化后的上述ELISA条件，用PBST将HRP标记的兔抗牛酶标抗体分别进行1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000稀释后进行ELISA反应，选择P/N值最大时的酶标抗体稀释度作为最适工作浓度。

1.2.9.5 特异性试验 按照优化后的ELISA方法，取实验室保存的牛副结核病阳性血清、牛结核病阳性血清、牛布病阳性血清、卡介苗免疫牛血清、健康牛血清进行检测以验证基于不同抗原的ELISA实验的特异性。

1.2.9.6 符合性试验 按照建立的ELISA方法对300份临床采集的牛血清进行检测，将检测结果与IDEXX副结核病抗体ELISA检测试剂盒检测结果进行比对，计算二者符合率。

2 结果

2.1 目的基因扩增与重组质粒双酶切鉴定 经过PCR扩增，成功获得了长度为1032 bp的MAP0862基因与555 bp的MAP1345基因，将两段基因混合后作为模板，经过重叠PCR，成功获得了长度为1617 bp的目的片段MAP1345-0862(图1)。重组质粒经EcoR I和XhoI双酶切，电泳可见有两条符合预期大小的条带(图2)，质粒送公司测序后将结果与MAP0862基因及MAP1345基因进行序列比对，符合率均为100%，表明成功构建了MAP0862-1345重组质粒，标注为pET-MAP0862-1345。

M：DL2000 Marker；1:MAP0862PCR产物；2:MAP1345 PCR产物； 3:MAP1345-0862 融合PCR产物图1 MAP0862、MAP1345、MAP0862-1345 PCR扩增图

M：DL5000 Marker；1,2:重组质粒MAP0862-1345双酶切鉴定图2 重组质粒pET-MAP0862-1345双酶切鉴定图

2.2 重组蛋白SDS-PAGE以及Western Blot鉴定SDS-PAGE凝胶电泳后可见重组菌表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在，使用尿素梯度透析的方法对蛋白进行复性，脱盐及纯化。纯化后的目的蛋白大小与预期相一致，约78 kD(图3)。纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，进行Western Blot分析，结果在预期的78 kD处出现杂交条带，表明纯化后的重组蛋白可以和牛副结核病阳性血清发生特异性免疫学反应，具备良好的反应原性(图4)。

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 优化后的ELISA条件 经过优化后的ELISA反应条件如下：重组蛋白使用碳酸盐缓冲液稀释至25 ng/mL，每孔100 μL,4 ℃包被过夜；PBST洗板3次后，加入含5%明胶的PBST溶液进行4 ℃过夜封闭；PBST洗板3次，加入使用PBST进行1∶100稀释的待检血清，37 ℃孵育30 min；PBST洗板3次后，加入使用PBST进行1∶10000稀释的兔抗牛酶标抗体，37 ℃孵育30 min；PBST洗板3次后，每孔加入100 μL TMB显色液，室温避光显色10 min，每孔加入50 μL 1 mol/L HCL终止反应，使用酶标仪读取OD450 nm数值。

M：蛋白分子量标准；1：重组菌超声后上清；2：重组菌超声后沉淀；3：纯化后的MAP1345-0862融合蛋白图3 重组蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白分子量标准；1：纯化后的MAP1345-0862融合蛋白图4 重组蛋白MAP0862-1345的Western Blot分析

2.3.3 特异性试验 使用初步建立的基于副结核特异性蛋白MAP0862-1345的间接ELISA方法对经鉴定保存的血清进行检测以验证该方法的特异性，其中副结核病阳性牛血清18份、布病阳性牛血清10份、牛结核病阳性血清15份、卡介苗免疫牛血清10份、牛健康阴性血清58份进行检测，结果见表2。

表2 重组蛋白ELISA特异性实验结果

2.3.4 符合性试验 使用建立的ELISA方法对300份牛血清进行检测，并将结果与IDEXX牛副结核病抗体检测试剂盒检测结果进行比对，分别计算阳性符合率、阴性符合率以及总符合率，结果见表3。阳性符合率：19/26*100%=73.1%；阴性符合率：259/274*100%=94.5%；总符合率：(19+259)/300*100%=92.7%。

表3 重组蛋白ELISA符合率结果

3 讨论

近年来，副结核病带来生产上严重的经济损失，以及潜在的人类生物安全威胁，引起研究者广泛关注[6]。鉴于机体感染副结核后存在细胞免疫与体液免疫分离现象，并且副结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌以及其他环境分枝杆菌存在共同抗原[7]，因此本研究中挖掘并验证具有鉴别诊断价值的串联表达抗原，初步建立适合不同感染阶段的血清学诊断的ELISA方法，具有重要意义。

虽然重组蛋白存在着抗原成分明确、易于质控与无生物危害的优点[8]。但如何保证两个重组蛋白的构象与功能是面临的难点，我们通过引入一段序列为G4S的柔性氨基酸将两个蛋白进行连接，从而确保两个蛋白的正确构象和功能[9]。Western Blot结果进一步证明经复性后的串联表达重组蛋白MAP0862-1345能与牛副结核病阳性血清发生特异性反应。

实验中将复性后所获的具有较高纯度的可溶性蛋白作为ELISA包被抗原，并优化筛选了ELISA反应参数，初步建立了基于副结核特异性蛋白MAP0862-1345的间接ELISA方法。但通过对58份健康牛血清的检测结果发现确定的临界值(OD450 nm为0.556)较高，主要原因可能由于纯化后的目的蛋白仍存在部分表达宿主菌BL21的蛋白，另外待检牛血清中可能存在与抗原蛋白含有交叉表位的大肠杆菌的抗体。比如在临床血清检测中，我们发现部分布病牛结核病阳性血清、牛结核阳性血清、卡介苗免疫牛血清被检测为阳性。

另外，IDEXX副结核病抗体检测试剂盒与本研究建立的方法检测300份临床血清样本，阳性符合率仅为73.1%，推断主要原因：一是副结核病抗体阳性样本较少导致阳性符合率低，如300份临床血清用IDEXX副结核病抗体检测试剂盒仅检测到26份副结核病抗体阳性血清；二是牛感染副结核后的不同时间段，其MAP0862蛋白、MAP1345蛋白的表达量不同，导致血清中针对该蛋白的特异性抗体含量不同，而当蛋白表达量较低时应用该方法则可能无法有效检出抗体。

总之，建立的MAP0862-1345间接ELISA方法，仍需要大量背景清楚的，不同感染阶段的人工感染血清样本进一步验证和完善。鉴于当前没有一种成熟的商品化副结核病血清学检测方法能够准确诊断不同感染期的血清样本[10]，因此针对可疑牛副结核病的实验室确诊仍需要综合采用多种不同检测方法。

[1] 白宇, 高艳, 高云航, 等. 鹿副结核病抗体间接 ELISA 检测方法的建立 [J]. 中国预防兽医学报, 2008, 29(12): 956-600.

[2] 吴雪琼, 张俊仙, 李洪敏, 等. 结核分枝杆菌 MPT64 蛋白的表达, 纯化及初步应用 [J]. 中国防痨杂志, 2001, 23(2): 85-88.

[3] Paustian M L, Amonsin A, Kapur V,etal. Characterization of novel coding sequences specific toMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis: implications for diagnosis of Johne's disease [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(6): 2675-2681.

[4] 牟巍, 蒋菲, 何宇, 等. 副结核分枝杆菌 map0862 基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J]. 中国兽药杂志, 2010, 44( 8): 10-12.

[5] 孟闯. 结核分枝杆菌抗原蛋白的表达, 免疫特性分析及在牛结核病检测中的初步应用 [D].万方数据资源系统, 2011.

[6] 孔繁德. 副结核分枝杆菌诊断技术的研究进展 [J]. 检验检疫科学, 2004, 14(B12): 57-60.

[7] Leite F L, Reinhardt T A, Bannantine J P,etal. Envelope protein complexes ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisand their antigenicity [J]. Veterinary Microbiology, 2015, 175(2): 275-285.

[8] 贾红, 鑫婷, 郭晓宇, 等. 牛结核病对人类健康的影响及其诊断方法 [J]. 微生物与感染, 2013, 9(1): 6-13.

[9] 韩小艳. Linker 长度对 MDC 和 CVB3VP1 融合基因疫苗免疫效果的影响 [D]. 河北医科大学, 2007.

[10]Deb R, Saxena V K, Goswami P P,etal. Diagnostic tools againstMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisinfection in animals: a review [J]. Agricultural Reviews, 2011, 32(1): 46-54.

(编辑：李文平)

Expression ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisMAP0862, MAP1345 and Primary Application in Indirect ELISA

ZHANG Zhen1,2,ZHANG Ge2,PENG Yong2, PENG Xiao-wei2, SUN Cui-li1,2,CHANG Wei-shan1, ZHU Liang-quan2*, DING Jia-bo2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgricultureUniversity,Taian,Shandong270018,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

To explore the effect of MAP0862 and MAP1345 in the diagnosis ofBovineparatuberculosis,the specific protein acquired by tandem expression was used as coating antigen after purified and quantification, an indirect ELISA was preliminary established after a series of optimization. The specificity of this method was verified by MAP antisera, Brucella antisera, Bovine tuberculosis(TB) antisera, BCG antisera and negative sera. The detection result of 300 sera showed that the coincidence rate of MAP0862-1345 indirect ELISA with commercial kit was 92.7%.

Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis; tandem expression;indirect ELISA

北京市科技新星计划(xx2013099)；现代农业人才支撑计划项目

张振，硕士研究生，从事重要人畜共患病诊断技术和新型疫苗研制方面的研究。

丁家波，E-mail:dingjiabo@126.com；朱良全，E-mail:zhuliangquan@ivdc.org.cn

2016-04-26

A

1002-1280 (2016) 06-0016-06

S852.5