好氧反硝化菌处理低浓度含氮污水

郭丽芸 时飞 杨柳燕 周国勤 茆建强

摘要：目前好氧反硝化菌生物脱氮的研究还处于试验阶段，且主要集中在对高浓度含氮废水的处理方面，对低浓度含氮污水很难做到深度处理。为解决这一问题，从富营养化的太湖表层水体中筛选3株好氧反硝化菌，经生理生化性能测定及分子生物学方法鉴定，分别为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不动杆菌（Acinetobacter sp.）、布鲁氏菌（Brucella sp.），株系分别命名为T1、N2、ADB-7。当碳氮比为9、pH值为7～9、温度为30 ℃、摇床转速为180 r/min时，菌株ADB-7的好氧反硝化效率最高。随后研究菌株T1、N2、ADB-7对人工生活污水及富营养化湖泊水样的氮素脱除情况。结果表明：24 h内菌株ADB-7对人工生活污水中硝态氮、氨态氮的去除率分别达54.32%、83.36%；菌株T1、N2对富营养化湖泊水樣硝态氮、氨态氮脱除效果较好，终浓度分别低于1.0、0.2 mg/L。由结果可知，菌株 ADB-7 短期脱氮效果好，而菌株T1、N2脱氮效果持久，可将3种菌制作混合微生物菌剂，用于环境水体氮素的脱除。

关键词：好氧反硝化；人工生活污水；富营养化湖泊；脱氮；微生物菌剂

中图分类号： S132；X172文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0523-04

近年来，随着社会经济的快速发展，工业废水及生活污水排放量日益增大，湖泊水质环境受到不同程度的污染，富营养化状况严重[1-2]。水体中的氨态氮、硝态氮都是严重的环境问题，其中氨态氮对鱼类和其他水生生物具有很强的毒性[3]，硝态氮能够破坏水生生物的免疫系统[4]。20多年来，我国科研工作者在湖泊富营养化的治理控制及氮素去除技术方面做了深入而广泛的研究，认为利用硝化-反硝化脱氮是最行之有效、无2次污染的技术[5]。

传统理念认为，反硝化作用是在无氧或厌氧条件下进行的。20世纪80年代中后期，首个好氧反硝化菌株的发现开启了人们研究好氧状态下脱氮作用的新领域[3]。好氧反硝化菌由于具備异养硝化-好氧反硝化能力，使得硝化、反硝化得以在同一个反应器中进行，且操作简便、运行成本低；同时，反硝化过程释放的碱可以补偿硝化过程中释放的酸，维持了体系酸碱度稳定，受到广大研究者的青睐[6-7]。国内外的专家学者也陆续从自然环境如池塘、底泥、活性污泥等生境中分离出具有好氧反硝化作用的菌株，如Alcaligenes[8]、Pseudomonas[9-10]、Bacillus[11]、Paracoccus、Rhodococcus[12]等。

目前国内对于好氧反硝化菌进行生物脱氮的研究基本处于试验的探索阶段[13-14]，分离得到的好氧反硝化菌菌株多用于对高浓度含氮废水进行脱氮处理[15]，处理后往往还有一定浓度的氮素残留，很难做到深度处理。因此，针对低氮浓度污水进行深度脱氮的研究成为水污染控制工程领域的热点。本研究从富营养化的太湖水体中筛选出好氧条件下能有效脱氮的菌株，并在实验室条件下应用该菌株对人工生活污水及富营养化湖泊水体进行模拟脱氮，以期为富营养化湖泊脱氮的实际应用提供生物材料和理论依据。

1材料与方法

1.1培养基及试剂

富集培养基：100 mmol/L NaNO3，2.84 g/L琥珀酸钠，0.27 g/L（NH4）2SO4，1.36 g/L KH2PO4，0.19 g/L MgSO4·7H2O，1 mL/L微量元素母液[16]，用去离子水补至相应体积，调节pH值至7.2，于 121 ℃ 灭菌20 min。

反硝化培养基：6.77 g/L柠檬酸三钠，2.0 g/L KNO3，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L KH2PO4，2 mL/L微量元素母液，用去离子水补至相应体积，调节pH值至7.0～7.5，于 121 ℃ 灭菌20 min。

溴百里酚蓝（Bromothymol Blue，BTB）琼脂平板：20 g/L琼脂，1 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L FeCl2·6H2O，8.5 g/L琥珀酸钠，1 mL/L BTB（1%溶于乙醇），用去离子水补至相应体积，0.15 g/L CaCl2调节pH值至7.0～73，于121 ℃灭菌20 min。

半固体BTB培养基：含10 g/L琼脂，其余成分同BTB琼脂平板。

人工生活废水：取校园生活污水，适当添加不同量的葡萄糖、KNO3、NH4Cl以及微量元素母液[16]后作为试验用水。

1.2好氧反硝化菌的分离

分别于江苏省无锡市太湖梅梁湾、贡湖湾及湖心等水域取表层水样100 mL，加入250 mL三角烧瓶中，在磁力恒温搅拌下，周期性加入少量（0.5 mL/h）富集培养基，于30 ℃富集培养24 h后取1 mL，分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9浓度梯度，再分别涂布BTB平板。由于反硝化是产碱过程，可使酸碱指示剂BTB变蓝，因此待长出单菌落后，挑取边界清晰、形态差异明显的蓝色单菌落，穿刺接种至半固体BTB培养基，选取培养基顶部颜色变蓝且培养基中有气泡产生（反硝化产物N2、NO或N2O）或培养基发生破裂的菌株为好氧反硝化阳性菌株。挑选好氧反硝化速率最高的3株菌，分别命名为T1、N2、ADB-7。

1.3菌株的形态学观察

对菌株T1、N2、ADB-7进行革兰氏染色，用光学显微镜及扫描电镜观察细胞形态，观察菌株是否形成菌膜、菌环，是否有运动性等，并观察菌落形态。

1.4菌株的分子生物学鉴定

以菌株T1、N2、ADB-7的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATC（A/C）TGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA序列。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经纯化后由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果通过GenBank BLAST进行比对，并用MEGA 4[17]软件构建系统进化树。

1.5菌株生长曲线的测定

取培养16 h的菌悬液于8 000 r/min离心2 min，用灭菌水洗涤2次后进行接种。250 mL三角瓶装100 mL反硝化培养基，以1%接种量于30 ℃、180 r/min恒温振荡培养，每2 h取样，测定菌体生物量（D600 nm），绘制生长曲线。

1.6不同条件对菌株ADB-7好氧反硝化能力的影响

以菌株ADB-7为代表菌株，采用250 mL三角瓶作为反应容器，在恒温摇床条件下分别测定不同pH值、温度、碳氮比（C/N）和溶解氧条件下菌株对反硝化培养基氮素的脱除效果。为控制溶解氧的不同，pH值分别取5、7、9，温度分别设为20、30、37 ℃，搅拌器转速分别设为100、120、180 r/min。分别在碳氮比为3、6、9时，测定菌株反硝化作用的強度。

1.7菌株低浓度氮素去除试验

配制人工生活污水，使硝态氮、氨态氮浓度各为25～30 mg/L。試验装置如图1所示，反应器容积为5 L，试验在室温下进行。取培养16 h的菌悬液1 000 mL，按上述方法离心后加入水样中，进水后启动搅拌装置进行有氧反应 23 h，静止沉降1 h后排水，取样并测定硝态氮、氨态氮的含量。

1.8富营养化湖水氮素去除试验

将取自江苏省无锡市太湖梅梁湾水样过滤、去除杂质后，加入到上述反应器中。每隔1个反应周期（23 h反应+1 h沉降）取样，测定各形态氮的含量。

1.9检测方法

水样经0.45 μm滤膜过滤后进行硝态氮、氨态氮含量的测定，硝态氮采用紫外分光光度法测定；氨态氮采用纳氏试剂光度法测定。

2结果与分析

2.1好氧反硝化菌的分离

经过富集培养、BTB平板涂布共获取48株具有好氧反硝化能力的菌株。经半固体BTB穿刺培养复筛后选取如图2中间试管的，培养基顶部变蓝（产碱）且有气泡产生（产气）的菌株为阳性菌株[18]，其中菌株T1、N2、ADB-7在较短时间内具有较强的反硝化作用。

2.2好氧反硝化菌的的形态学观察

2.5不同条件对好氧反硝化效率的影响

由于菌株ADB-7前期脱氮效率较高，因此测定不同条件对该菌株反硝化作用的影响试验。由图6-a可见，碳氮比对菌株的好氧反硝化效率具有较大影响，碳氮比越高，好氧反硝化效率越高，这是由于该菌株为异养微生物，需要外界环境为其提供有机物以维持菌体自身生长和代谢[7]；当碳氮比为9时，菌体脱氮效果良好。酸碱度也是影响好氧反硝化菌进行反硝化作用的1个重要影响因素[7]。由图6-b可见，在中性（pH值=7）、碱性（pH值=9）环境下，菌株ADB-7的反硝化作用明显强于酸性条件。此外，温度对菌株的好氧反硝化作用也有明显影响，温度高于30 ℃时，菌株的好氧反硝化作用明显增强，详见图6-c。但是，由于30、37 ℃条件下二者效果相差不大，且考虑到环境中的实际温度除夏季外很少达到37 ℃，因此本研究将30 ℃定为最适温度，用于后续的研究。由图6-d可见，通过控制摇床转速来控制反应器的溶解氧含量，结果发现在摇床转速为180 r/min时，菌株反硝化速率较高，说明该菌株为好氧反硝化菌株，其反硝化作用酶系不受氧气抑制。

2.6人工生活废水的氮素去除效果

由表2可见，有氧反应24 h后，水体的氮素浓度均有明显下降，菌株对于硝态氮的去除率为35%～54%，而对于氨态氮的去除率则更高，达到61%～83%，这是因为微生物会优先利用氨态氮而非其他形态氮素构建生物量[19-20]。乔楠等通过研究好氧反硝化菌菌株H1对硝态氮、氨态氮的利用情况认为，在碳源充足的情况下，菌株优先利用氨态氮，而对硝态氮的利用不显著或明显滞后[21]。因此，菌株ADB-7对硝态氮的去除效率仍有提高空间，菌株ADB-7对硝态氮、氨态氮的去除效率均较其他2种菌株高。

2.7富营养化湖泊水样模拟脱氮试验

由图7可见，菌株对水体的硝氮确实存在还原作用。在前60 h，菌株ADB-7去除硝态氮、氨态氮的效率均高于菌株T1、N2，说明菌株ADB-7具有快速脱氮的效果，这与人工生活废水的氮素去除试验结果（24 h内）一致；同时可见，菌株ADB-7对于硝态氮的利用率较高，而对于氨态氮的利用率较低，说明菌株ADB-7用于构建生物量的氮素并不多[19-20]，因此其生物量的增加并没有菌株T1、N2幅度大（图5）。在60 h后，菌株T1、N2的脱氮效果明显增强，且强于菌株ADB-7，硝态氮、氨态氮的终浓度维持在较低水平，分别低于1.0、0.2 mg/L。因此，菌株ADB-7快速脱氮效果较好，而菌株T1、N2的脱氮持久性较好，可考虑将三者按照不同比例做成高效脱氮菌剂，用于环境水体的脱氮处理。

3结论

从自然水体中分离纯化得到3株好氧反硝化菌菌株，经鉴定后分别命名为（30 ℃）、碳源充足（碳氮比为9）和一定的溶氧量（摇床转速 180 r/min）条件下，菌株的氮还原能力达到最优。3株菌均可在好氧条件下对人工生活污水和富营养化湖泊水样进行硝态氮和氨态氮的脱除。菌株ADB-7具有快速脱氮的特点，而菌株T1、N2则可持久脱氮。可将3个菌株混合制作微生物制剂，用于富营养化湖泊的氮素控制。

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