温和灸皮肤神经性TRPV1启动机制及对内脏痛的效应机制研究

郑桂芝 李 晗 吴焕淦， 马晓芃 方臻臻 马 喆 周次利 施 征 刘慧荣，

(1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437； 2 上海中医药大学上海市针灸经络研究所，上海，200030)

温和灸皮肤神经性TRPV1启动机制及对内脏痛的效应机制研究

郑桂芝1李 晗1吴焕淦1，2马晓芃2方臻臻1马 喆1周次利2施 征2刘慧荣1，2

(1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海，200437； 2 上海中医药大学上海市针灸经络研究所，上海，200030)

目的：围绕体表神经性瞬时电位感受器香草酸亚型1(Neuronal Transient Receptor Potential Vanilloid 1，nTRPV1)研究温和灸皮肤启动机制和对内脏痛模型的镇痛效果。方法：野生型C57BL/6小鼠作为主要研究对象。于8周龄时予130 μg/mL硝基苯磺酸灌肠(Three Nitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS)诱导慢性内脏痛模型小鼠。12周龄时，温和灸组(Moxibustion，Mox)和假温和灸组(Sham Mox)的小鼠足三里穴区接受温和灸刺激，Mox的穴区皮肤温度控制在(45±1)℃，而Sham Mox控制在(37±1)℃。借用腹部撤回反射评分(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)作为疼痛主要观察指标。使用神经纤维素蛋白(Protein Gene Product 9.5，PGP9.5)和TRPV1免疫荧光双标，观察艾灸对于nTRPV1的影响。同时使用TRPV1阻断剂——辣椒平(Capsazepine，CPZ)，分别以高、低剂量阻断体表TRPV1，观察Mox的镇痛和体表nTRPV1的表达。另外，又分别使用坐骨神经结扎和树脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)阻断皮下nTRPV1，研究Mox的镇痛和体表nTRPV1表达。结果：相对于Sham Mox，Mox显著改善了内脏痛模型小鼠的AWR评分(P<0.05)和促进nTRPV1的表达量增加。使用CPZ阻断后，Mox未能引起AWR的改善，但低剂量的CPZ无法抑制Mox引起的nTRPV1的增多。而使用nTRPV1阻断方式后，发现体表的nTRPV1显著减少。Mox不能有效的发挥镇痛效果，而且不能促进nTRPV1的增多。结论：温和灸可能通过影响体表nTRPV1的方式，对内脏痛模型发挥相应的镇痛效果，阻断nTRPV1之后，温和灸镇痛效果消失。

温和灸；内脏痛；体表神经性TRPV1；镇痛；皮肤启动机制

慢性内脏疼痛是炎症性肠病和肠易激综合征患者的临床常见症状。与躯体痛研究相比，内脏痛觉的研究还处于初级阶段，各方面机制尚不明确[1]。针对内脏痛的治疗，全世界学者尝试探索各种方式来治疗此病，我们课题组前期研究证明了艾灸对内脏痛存在调整作用[1-2]。

一般认为，艾灸通过刺激体表相应腧穴，通过一系列的神经、血液等通路，对相应靶器官发挥调整。所以，艾灸通过影响腧穴位置皮肤组织，进而将此刺激信号传入体内，是艾灸发挥作用的首要途径[5]。围绕艾灸对皮肤如何产生影响，产生何种影响的研究，称之为艾灸皮肤启动机制。

人体体表的瞬时感受器电位家族(Transient Receptor Potential，TRP)主要扮演着感受外界的不同温度的角色，研究发现TRP受体不同亚型可被不同温度激活，如TRPV1≥43 ℃，TRPV2≥52 ℃，TRPV3≥33 ℃，TRPV4≥27 ℃。巧合的是，朱琏在1954年提出温和灸时，就强调温和灸对机体的刺激温度为42～43 ℃[3]。结合TRPV1特异性的激活温度，学术界开展很多围绕温和灸和体表TRPV1的研究[4-6]，发现艾灸激活TRPV1后，对靶器官存在良性调整作用，而阻断体表的TRPV1后作用消失[7]。

体表TRPV1主要分成神经性TRPV1(Neuronal TRPV1，nTRPV1)和非神经性TRPV1(Non Neuronal TRPV1，nnTRPV1)[8]。研究认为nTRPV1被激活后，促进细胞外Ca2+的内流，可以直接作用于神经末梢，引起神经电冲动，而非non-neuronal trpv1可能更多参与体表各种皮肤疾病的形成[9]。另有研究发现，使用坐骨神经结扎(Sciatic Nerve Ligation，SNL)和皮下树脂毒素(Resiniferatoxin，RTX)注射，可有效抑制nTRPV1的表达[10]。

本研究假设温和灸刺激皮肤足三里穴区激活nTRPV1，进而对内脏痛模型小鼠发挥镇痛作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄野生型C57BL/6小鼠(购于上海斯莱科实验动物公司)，饲养于上海中医药大学动物实验中心(温度21±1 ℃，湿度50%～70%，12 on/12 off光照循环)。小鼠购入后置于动物房适应环境1周后开始实验。

1.2 主要试剂与仪器 清艾条(0.5 cm×10 cm，南阳艾条厂)、三硝基苯磺酸(Three nitrobenzene sulfonic acid，TNBS，美国Sigma公司)、戊巴比妥钠(德国Merck公司)、神经纤维丝蛋白抗体(Protein gene product 9.5，PGP9.5，美国Abcam公司)、TRPV1抗体(美国Abcam公司)、辣椒平(Capsazepine，CAP，加拿大J&K公司)、吐温-80(美国Sigma公司)、RTX(上海江莱生物科技有限公司)、红外热成像仪(日本NEC公司)。

1.3 实验分组 本项实验一共分成3个部分：实验一研究艾灸体表温度控制在(45±1)℃和(37±1)℃温和灸镇痛效果；实验二使用高、低两个剂量的CPZ干预后，观察(45±1)℃温和灸镇痛效果；实验三使用SNL和RTX干预后，观察(45±1)℃温和灸镇痛效果。

实验一：一共分成4组，即空白组(Control)、模型组(Model)、(45±1)℃温和灸组(Mox)和(37±1)℃温和灸组(Sham Mox)。

实验二：一共分成5组，即Model组、Mox组、低剂量CPZ(LCPZ)组、LCPZ+Mox组、高剂量CPZ(HCPZ)组、HCPZ+Mox组。

实验三：一共分成5组，即Model组、Mox组、RTX组、RTX+Mox组、SNL组、SNL+Mox组。

1.4 模型制备 造模药物配置方案：130 μgTNBS：5%的TNBS原液0.1 mL与30%乙醇38.5 mL混合。

于小鼠8周龄开始造模，实验前小鼠禁食12 h。使用0.5%戊巴比妥钠经腹腔注射后，小鼠完全麻醉后，使用婴儿棉签蘸取少量液体石蜡以润滑、扩张肠道，抽取0.1 mL配置好的TNBS，使用小鼠灌胃针经肛门插入3 cm，缓慢注入TNBS药物(如果有药物溢出，重新吸取益处药物，再次缓慢注入)，小鼠于注药后，倒置10 min，防止药物溢出[11]。小鼠造模4周，于12周龄时开始艾灸干预。

1.5 艾灸干预 待小鼠12周龄时，将清醒状态的小鼠固定于特殊固定器，使用红外热成像仪测温，将测温点定位于小鼠双腿足三里穴区。点燃艾条后，对准足三里穴区行温和灸。10 min/d，连续7 d。见图1。其中Mox组的测温点温度控制在(45±1)℃，Sham Mox组的测温点温度控制在(37±1)℃，整个测温过程中，根据红外热像成像仪特有属性(温度不同、色带不同)，以保证足三里穴区的温度，是小鼠体表温度最高点。

1.6 辣椒平注射 本实验使用50%的二甲亚矾生理盐水溶液作为有效溶剂，配置0.4 mg/mL和4 mg/mL的不同剂量的CPZ药物，每次温和灸干预前30 min给予穴区注射，单次注射100 μL的量[12-13]。

1.7 坐骨神经结扎 于10周龄入组小鼠进行双下肢坐骨神经选择性结扎，用0.5%戊巴比妥钠腹腔麻醉，下肢剃毛，碘伏消毒，暴露腘窝坐骨神经，用7-0尼龙线进行结扎坐骨神经，逐层缝合肌肉皮肤，小鼠臀部注射20万U的青霉素以防止感染，每天给予伤口碘酒消毒[14]。

1.8 树脂毒素注射 RTX溶于96%无水乙醇的溶液，浓度为3 μg/mL、7 μg/mL、10 μg/mL。小鼠给药剂量为30、70、100 μg/kg皮下注射，皮下连续注射3 d。对于10周龄入组小鼠，用0.5%戊巴比妥钠麻醉，下肢剃毛，再用50 μL注射器，1 μL/g/只剂量从低浓度到高浓度连续注射3 d RTX溶液[14]。

1.9 腹部撤回反射评分 小鼠内脏痛的评估方式，采用腹部撤回反射评分(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR)，于艾灸前1 d和艾灸结束后1 d进行评分。见图1。

图1 实验流程图

注：整个治疗周期一共9 d，第1、9天行AWR评估，第2～8天进行艾灸干预。

在清醒状态下，用布袋包裹小鼠上半身，用婴儿棉签蘸取少量液体石蜡，以润滑、扩张小鼠直肠，插入特制气囊。使用医用胶布包裹送气管道和鼠尾，并置于金属网格平面上，用8 cm×3 cm×4 cm的透明长方体作为密闭器固定住小鼠。小鼠于插入气囊后静置30 min后，用血压计连接三通管，用5 mL注射器向气囊注入空气，行直肠扩张，判定AWR评分。

分别给于15 mmHg、30 mmHg、45 mmHg、60 mmHg 4个不同压力等级的结直肠扩张刺激。单次扩张时间20 s，间隔30 s，4个梯度扩张完成后，小鼠休息5 min进行下一轮不同等级的直肠扩张，一共重复3次，取3次平均值作为最终评分值。

1.10 结肠组织病理学观察 将4%多聚甲醛溶液固定的实验一的小鼠结肠样本，经脱水、透明、透蜡，石蜡包埋，常规切片后进行HE染色，光镜下观察结肠组织病理学变化，以判断造模对肠道组织的影响。

1.11 皮肤组织免疫荧光观察 为了研究nTRPV1，使用PGP9.5特异性的标记皮肤神经末梢纤维组织，与TRPV1进行免疫荧光双标，双标区域即为nTRPV1的所在位置。小鼠处死后，摘取足三里穴区皮肤组织，直接液氮快速冷冻，皮肤冻存于-80 ℃冰箱。采用石蜡切片的方式，制成皮肤切片。经烤片、脱蜡、水化、抗原修复、一抗孵育、二抗孵育、封片和拍照。

1.12 统计学方法 本实验所有数据采用均数±标准差(mean±SD)描述。AWR分析使用单因素方差分析，当方差齐性时，使用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验。SPSS 20.0(IBM，US)为主要统计软件，当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠道组织的病理学观察 8周龄小鼠接受TNBS造模，待12周后，予温和灸干预，发现Model和Control均表现为正常的肠道组织，腺体结构完整、无炎性物质渗出、无脓肿、无炎性反应细胞浸润。同时Mox和Sham Mox存在相同的表现。见图2。说明TNBS成功诱导肠道炎性反应后诱发的内脏痛模型，肠道组织无黏膜损伤。

图2 肠道组织病理切片

注：Control：空白组；Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；Sham Mox：温度控制在(37±1)℃的温和灸。

2.2 Mox和Sham Mox对内脏痛及皮下nTRPV1的影响 TNBS诱导的慢性内脏痛小鼠，Model组的AWR比Control组明显增高(P<0.05)。同时，使用Mox和Sham Mox干预后，小鼠AWR评分显著下降，其中Mox组对AWR的改善更明显。见图3。突出了Mox对内脏痛的改善效果。对各组足三里穴区皮肤nTRPV1进行免疫荧光分析，Mox组明显增多了nTRPV的表达，而Sham Mox却没有增多。见图4。说明超过TRPV1激活温度的刺激后，可以促进nTRPV1的表达。

2.3 高、低浓度CPZ阻断后，Mox对内脏痛和皮下nTRPV1的影响 使用高、低不同浓度的CPZ干预后，发现Mox不能改善小鼠AWR评分，说明在阻断体表TRPV1之后，Mox对小鼠的镇痛效果消失，提示Mox可能通过激活TRPV1后抑制内脏痛。见图5。值得注意的是，nTRPV1免疫荧光分析，LCPZ+Mox依然可以促进nTRPV1的表达，但是HCPZ+Mox的nTRPV1没有变化。说明低浓度CPZ尚不能抑制Mox对nTRPV1的影响。见图6。

图3 实验一AWR评分

注：Control：空白组；Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；Sham Mox：温度控制在(37±1)℃的温和灸。#：P<0.05、##：P<0.01 v.s.Control；*：P<0.05、**：P<0.01 v.s.Model。

图4 实验一皮肤免疫荧光

注：Control：空白组；Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；Sham Mox：温度控制在(37±1)℃的温和灸。

图5 实验二AWR评分

注：Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；LCPZ：0.4 mg/mL辣椒平；HCPZ：4 mg/mL辣椒平。

2.4 SNI和RTX干预后，Mox对内脏痛和皮下nTRPV1的影响 使用SNI和RTX干预后，发现Mox亦不能改善内脏痛模型的疼痛水平。见图7。SNI和RTX均可以明显抑制nTRPV1的表达，而且Mox不能促进其表达。见图8。说明在SNI和RTX抑制了皮下nTRPV1的表达，Mox不能发挥镇痛作用。而且Mox也不能促进nTRPV1的表达，提示Mox可能通过激活nTRPV1，进而发挥镇痛效果。

图6 实验二皮肤免疫荧光

注：Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；LCPZ：0.4 mg/mL辣椒平；HCPZ：4 mg/mL辣椒平。

图7 实验三AWR评分

注：Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；RTX：树脂毒素；SNL：坐骨神经结扎。

3 讨论

本项研究发现Mox可以有效对内脏痛模型小鼠发挥镇痛效果，内脏痛评分AWR值明显降低，同时可以促进皮下nTRPV1的表达。使用CPZ阻断皮肤TRPV1，发现Mox不能发挥镇痛作用，同时CPZ有效的阻断了Mox引起的nTRPV1的增多。在此基础上，根据体表TRPV1分成nTRPV1和nnTRPV1，通过上述研究发现nTRPV1在Mox皮肤启动机制中扮演更重要的作用，Mox通过刺激神经末梢的nTRPV1，激发神经电紧张，影响神经中枢，从而发挥镇痛作用。所以采用特异性阻断nTRPV1的方式——SNI和RTX，双重观察Mox对nTRPV1的影响，结果发现Mox没有镇痛效果且nTRPV1并未增多。

图8 实验三皮肤免疫荧光

注：Model：模型组；Mox：温度控制在(45±1)℃的温和灸；RTX：树脂毒素；SNL：坐骨神经结扎。

过去学术界使用TRPV1激动剂，观察TRPV1激活之后，对疼痛的调整效果[15-16]。TRPV1激活之后，钙离子大量内流，引起一系列细胞内信号通路激活，细胞膜渗透压增高，囊内TRPV1激活，线粒体肿胀，进而引起神经细胞感觉功能丧失和脱敏[17]。故认为大于43 ℃温和灸也可能通过此机制调整内脏痛，此温度是TRPV1特有的激活温度。在本项研究中，我们使用红外热像仪将温度控制在(45±1)℃的温和灸为主要干预手段，(37±1)℃温和灸作为对照，以突出激活TRPV1后特有的镇痛表现，结果发现Mox确实存在镇痛效果。

过去围绕艾灸皮肤启动机制的研究，都认为艾灸后可以引起体表TRPV1的增多。王玲玲等用温和灸对高脂血症的调整效果，比较了38 ℃和45 ℃的温和灸，发现45 ℃在降低三酰甘油和胆固醇方面优于38 ℃灸，从而可以降低动脉粥样硬化形成的风险，并发现45 ℃可以促进TRPV1的表达含量增高[18]，在此基础上使用CPZ可以有效阻断艾灸引起的降脂效果[19]。张承瞬在躯体疼痛模型上也发现了艾灸对TRPV1的促进作用，认为艾灸通过激活TRPV1，而发挥镇痛作用[20]。所以在我们的研究中使用CPZ阻断体表TRPV1，发现艾灸的镇痛效果消失。

结合已有的研究结果，我们认为可能艾灸的穴区启动机制和nTRPV1联系更为紧密，通过激活nTRPV1，直接可以影响神经中枢。所以我们在实验二的基础上又设计实验三。研究发现，特异性的阻断nTRPV1后，Mox的镇痛效果消失。同时Mox可引起nTRPV1增多，Sham Mox没有促进其表达。使用CPZ阻断TRPV1，Mox镇痛效果消失，但是LCPZ+Mox依然促进了nTRPV1的增多，可能CPZ的浓度太低，无法抑制Mox促进nTRPV1的表达。针对nTRPV1，使用特异性的阻断方式，均发现降低了nTRPV1的表达，而且Mox不能促进其表达。

本项研究初步探索了艾灸和nTRPV1的关系，认为可能艾灸通过激活nTRPV1，影响中枢系统，调整内脏疼痛。但是依然存在一些问题需要改进。首先针对和肠道内脏痛联系较为紧密的低位中枢，我们今后将纳入更多的观察指标，证明Mox镇痛分子机制。其次，现有的检测nTRPV1的手段，可以采用同位素特异性的标记进行定量分析，但是本课题组缺乏开展同位素研究资质，且相关单位也不提供技术支持，导致只能使用免疫荧光的方式，标记nTRPV1做定性分析[21]。最后，艾灸通过激活nTRPV1，影响中枢神经系统，其具体通路如何，需要深入的探索。

综上所述，本项研究初步探明超过TRPV1激活温度的温和灸，促进皮下nTRPV1的表达，对内脏痛模型小鼠发挥有效的镇痛作用。然而，当TRPV1阻断或是nTRPV1抑制后，温和灸的镇痛效果被明显抑制。说明温和灸通过激活nTRPV1的方式，影响中枢神经系统，对内脏痛发生调整效果。

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(2016-12-07收稿 责任编辑：洪志强)

Effect of Warm Moxibustion on Cutaneous Neuronal TRPV1 and Visceral Pain

Zheng Guizhi1，Li Han1，Wu Huangan2，Ma Xiaopeng1, Fang Zhenzhen1，Ma Zhe1，Zhou Cili2，Shi Zheng2,Liu Huirong1

(1YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China)

Objective:To study the relationship between the cutaneous starting mechanism and the analgesia effect of warm moxibustion on visceral pain by the cutaneous neuronal transient receptor potential vanilloid 1 (nTRPV1). Methods:SPF wild type C57BL/6 mouse were involved in this study. At the week 8, the visceral pain was modeled by 130 μg/mL TNBS injected into the colon in SPF C57BL/6 wild type mice. During the week 12, mice in the Mox group and Sham Mox group received warm moxibustion on ST-36. The cutaneous temperature was controlled around (45±1)℃ in the Mox group while (37±1)℃ in the Sham Mox group. The analgesia effect of moxibustion was assessed by Abdominal withdrawal reflex (AWR). And nTRPV1 in the cutaneous were observed by immunofluorescence which was marked with protein gene product 9.5 (PGP9.5) and TRPV1. Low and high volume capsazepine (CPZ) inhibiting cutaneous TRPV1 activity were involved to observe the changes of analgesia effect and the nTRPV1 expression. Furthermore, sciatic nerve ligation (SNL) and resiniferatoxin (RTX) inhibiting nTRPV1 activity were used to study the differences of analgesia and nTRPV1 expression respectively. Results:Comparing with Sham Mox, Mox significantly reduced the AWR score in the visceral pain mice (P<0.05), and increased the expressions of nTRPV1. After CPZ being involved, the analgesia effect of Mox was inhibited, but low volume CPZ was not able to inhibit the promotion of nTRPV1 by moxibustion. Both SNI and RTX involved were able to inhibit the analgesia and the nTRPV1 of moxibustion. Conclusion:Warm moxibustion is able to improve the pain level of visceral pain which may be mediated by the cutaneous nTRPV1. After blocked the TRPV1 in the skin, the analgesia of warm moxibustion disappeared.

Warm moxibustion; Visceral pain; Cutaneous neuronal TRPV1; Analgesia; The starting mechanism of the skin

国家重点基础研究发展计划(“973”计划)项目(编号：2015CB554501；2009CB522900)；国家自然科学基金项目(编号：81574081)；上海市重点学科资助项目(编号：S30304-A9、S30304-A13)

吴焕淦(1956—)，男,汉族，浙江仙居人，上海中医药大学上海市针灸经络研究所，首席教授，博士研究生导师，主要从事针灸作用的临床与基础研究，E-mail：wuhuangan@126.com；刘慧荣(1976—)，女，河北省容城县人，汉族，2004年上海中医药大学毕业，博士研究生导师，研究员，主要从事针灸治疗胃肠疾病的临床和基础研究

R245

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.002