液态羟基磷灰石胶原海藻酸钠（Alg/nHAC）人工骨促进Ilizarov骨延长骨愈合的实验研究*

朱超王华刘伟王邵清王斌冯庆玲刘新晖*

液态羟基磷灰石胶原海藻酸钠（Alg/nHAC）人工骨促进Ilizarov骨延长骨愈合的实验研究*

朱超1王华1刘伟1王邵清1王斌1冯庆玲2刘新晖1*

目的探讨应用液态海藻酸钠/纳米羟基磷灰石/胶原（Alg/nHAC）促进肢体延长过程中骨愈合的作用。方法制备液态可注射Alg/nHAC人工骨，建立兔胫骨骨延长动物模型，随机分两组，A组，骨延长区给予微创注射Alg/nHAC人工骨，B组作为空白对照，分别在延长后2、4、8周进行组织学，X线检查、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力学的检测观察延长区骨愈合情况。结果延长后2、4、8周，A组在组织学、新生骨小梁百分比、骨密度以及生物力学的检测均明显优于B组，A组8周时间骨延长区已经愈合。结论液态羟基磷灰石胶原海藻酸钠（Alg/nHAC）人工骨可以通过微创注射的方式促进延长区骨愈合，为临床促进骨愈合提供了新的方法。

海藻酸钙/纳米羟基磷灰石/胶原；伊力扎洛夫；骨愈合

随着Ilizarov牵拉骨再生的生物学原理的创立及其在临床中的应用，给肢体延长技术带来了革命性的变化。但是临床中发现，随着延长幅度的加大，延长后的并发症逐渐增加，其中骨愈合较缓慢是其中重要的并发症之一[1]，本实验通过建立兔胫骨肢体延长的动物模型观察了和探讨了应用液态海藻酸钠/纳米羟基磷灰石/胶原（Alg/nHAC）微创法促进肢体延长过程中骨愈合的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康新西兰大耳白兔60只，南京医科大学大学实验动物中心提供（2～2.5kg），海藻酸钠/纳米羟基磷灰石/胶原（Alg/nHAC），12mm克氏针，飞利浦500mAX线机拍片，IPP（Image-ProPlusIPP）Mediaplayer，DEXAUNIT-2000双能 X线骨密度仪器，USS生物力学试验机，自动脱水机TP102，切片机2125，自动石蜡包埋机 TKY-BM，烤片机HI1220，推片机HI1210，双目照相奥林巴斯显微镜CX31，图像分析系统。

1.2 兔胫骨肢体延长动物模型的制备[2]

新西兰大耳白兔（2～2.5kg），术前禁食，备左后肢皮肤，1%戊巴比妥钠静脉麻醉（3mg/kg）。麻醉成功后，兔仰卧于兔台，消毒铺单。先用电钻在胫骨结节上方约1.0cm处交叉钻入2枚1.2mm克氏针，安装预先装配好的外固定架的一个环，并将克氏针固定在钢环上，远端也交叉钻入2枚1.0mm克氏针，与近端克氏针相对应，同样用螺栓将针固定在钢环上。调整外固定架，使外固定架牢固，平行。在无菌条件下于上、下2组钢针之间取胫骨前外侧纵行切口，深达骨膜，并于骨膜下剥离，显露胫骨上段，小心撬断腓骨下端，并用线锯于胫骨结节下完全截断胫骨，调整外固定架，使骨折两端靠拢并保持解剖对位，拧紧所有的螺帽。冲洗伤口，缝合骨膜后关闭切口（图1，图2）。（彩图见插页）术后应用青霉素40万U肌肉注射5天，同时在刀口及针道处安尔碘湿敷，预防感染。术后第5天开始延长，延长速度为1mm/d，分2次完成，共20天，延长20mm。延长完成后固定9周。按相同条件常规饲养，任兔在笼中自由活动。定期处死动物，取标本。

图1 横行截骨后

图2 兔胫骨肢体延长动物型制备术后

1.3 海藻酸钠/纳米羟基磷灰石/胶原（Alg/nHAC）的制备[3]

1.4 动物分组

取60只新西兰大耳白兔，（2～2.5kg），随机分成A、B两组，每组30只。待延长结束后，A组延长区注射液态Alg/ nHAC，B组未给与任何处置作为对照。A、B两组在相同条件下进行造模及饲养，任兔在笼中自由活动。定期处死动物，取标本。

1.5 观察指标

1.5.1 大体观察

观察术后伤口愈合情况，针道是否感染及日常活动情况，延长区大体标本成骨情况。

1.5.2 组织学观察

分别在骨延长中期及结束后、延长结束后第2、4、8周处死动物取材，标本用10%甲醛固定，已骨化的标本脱钙2周，石蜡包埋切片，HE染色，封片后光镜下观察。

1.5.3 X线观察

术后、骨延长结束后及延长结束后第2、4、8周，飞利浦500mAX线机拍片，曝光条件为：50KV，4ms。观察延长部位的成骨及骨痂形成情况。

1.5.4 骨小梁百分比面积测定

镜下观察组织切片，采集图像，应用 IPP（Image-Pro PlusIPP）Mediaplayer形态计量软件测定骨小梁百分比面积测定

1.5.5 骨密度测定

于延长结束后8周，每组各处死5只兔子取材，在DEXAUNIT-2000双能X线骨密度仪器测定骨密度。

1.5.6 生物力学测定

分别与 2、4、8周兔胫骨延长区进行三点弯实验。A组、B组每个时间段各5个标本，并取对侧正常胫骨5个标本设为C组做对照。标本中点为支点，两端固定，以30mm为跨距，以0.5mm/min的恒定速度均匀缓慢加载至其断裂，取均值对比各组最大应力值。

1.6 统计学方法

所得数据用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料用（±s）表示，组间比较采用t检验。＜0.05或0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

术后兔子饮食、活动正常，患肢轻度肿胀，1～2周后消肿，切口均正常愈合。实验过程中有2只兔子因腹泻死亡，2只兔子于克氏针固定处骨折，上述动物排除实验，剩余兔子均生存到实验所需的各时间段。外固定架固定可靠，未对动物产生不良影响。

2.1 大体观察

骨延长结束后取标本10个，见延长区为致密纤维结缔组织，质柔韧，未见骨化。延长结束后第2周，共处死10只兔子取标本，每组5个。A组延长区大部分骨化，手术刀片切割骨痂较困难；B组延长区少部分骨化，仍存在大部分纤维结缔组织。延长结束后第4周，共处死10只兔子取标本，每组5个。A组延长区已完全骨化，但强度但强度较健侧弱，可轻易用手折断；B组延长区基本已骨化，骨痂强度不大，可用手术刀片切割。延长结束后第8周，共处死10只兔子取标本，每组5个。A、B组延长区全部骨化，A组外观已与正常骨相类似，用手难于折断；B组可轻易用手折断。手术侧胫骨与健侧胫骨比较，延长了2cm。

2.2 组织形态学观察

延长中期及结束后：共处死10只兔子取标本，中期5个，延长结束后5个。延长区为致密纤维结缔组织充填，未观察到骨组织。延长结束后第2周：共处死10只兔子取标本，每组5个。A组植入的材料被纤维性结缔组织分割。纤维性结缔组及血管长入植入材料的内部，在大部分材料中间能看到纤维性骨痂为主的类骨质形成，而被分割材料的周边出现少量的骨性骨痂；B组以纤维结缔组织为主，有少量的类骨质形成。延长结束后第4周：共处死10只兔子取标本，每组5个。A组：可见大部分成熟骨，骨陷窝及其内骨细胞的数量明显增加，植入的材料明显减少；B组出现大量类骨质出现，形成编织骨，骨小梁渐成熟，部分成骨细胞逐渐成熟变为骨细胞，骨小梁较2周时增多，仍以幼稚骨小梁为主。延长结束后第8周，共处死10只兔子取标本，每组5个。A组：注入的材料基本消失，大量的成熟骨性骨痂形成（图3）（彩图见插页）；B组以大量纤维行骨痂和骨性骨痂为主，有少量的成熟骨陷窝及骨细胞出现（图4）（彩图见插页）。

图3 延长结束后第8周A组：注入的材料基本消失，只有在中心存在有极少量的材料，大量的成熟骨性骨痂形成（HE×100）

图4 延长结束后第8周B组以大量纤维行骨痂和少量的骨性骨痂为主，有成熟骨陷窝及骨细胞出现（HE×100）

2.3 X线检查

术后即刻拍片示胫骨截骨完全，腓骨亦断开，截骨处对位、对线佳；延长后10天拍片示截骨部位已牵开，对位对线良好；延长结束后即刻拍片，牵开约2cm，对位对线良好，延长区低密度显影，未见钙化（图5）。A组注射液态Alg/nHAC也为低密度显影（图6）。延长结束后第2周：A组大量的高密度影形成并充填于延长区；B组仅见少量高密度显影，即仅有少量的新生骨形成，延长区大部分为低密度显影。延长结束后第4周：A组延长区高密度较2周明显增高增多；B组骨痂量较2周时增多，但比A组少。延长结束后第8周：A组影像表现已接近正常骨，髓腔贯通，延长区皮质骨与上下邻近部位正常骨密度相似（图7）；B组延长区全部骨化，但骨密度较低，骨量不多（图8）。

图5 延长结束后即刻拍片牵开约2cm，对位对线良好，延长区低密度显影，未见钙化

图6 A组注射液态NHAC/Alg也为低密度显影

图7 延长结束后第8周A组影像表现已接近正常骨，髓腔贯通，延长区皮质骨与上下邻近部位正常骨密度相似

图8 延长结束后第8周B组延长区全部骨化，但骨密度较低，骨量不多

2.4 骨小梁百分比面积测定

本实验共获取30个标本，其中2周时：10个标本（A组5个，B组5个）；4周时：10个标本（A组5个，B组5个）；8周时：10个标本（A组5个，B组5个）。测定结果经统计学分析显示A、B两组分别在2、4、8周有显著性差异，＜0.01；A组的骨小梁百分比面积明显高于B组，见表1。

表1 两组动物在不同时间段骨小梁百分比面积比较（±s）

表1 两组动物在不同时间段骨小梁百分比面积比较（±s）

组别 2周 4周 8周A组B组值7.1 9.60值11.2±2.01 32.42±2.88 51.49±9.28 4.51±1.83 18.68±3.77 33.11±4.11 10.9＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.5 骨密度测定

本实验8周时共获取10个标本：（A组5个，B组5个）。以对侧正常胫骨（取10个标本）作为C组测量正常值。

A 组 BMD 为（0.1240±0.0069）、B 组 BMD 为（0.0873±0.0042）、C组BMD为（0.1771±0.0078）。A组在8周时BMD高于B组。两组之间有显著性差异（＜0.01）。A组在8周时恢复到正常值的70.29%，B组恢复到正常值的49.29%，两组之间有显著性差异（＜0.01）。

2.6 生物力学测定

本实验8周时共获取10个标本：（A组5个，B组5个），并取5个对侧正常胫骨（取10个标本）作为 C组测量正常值。

A组的最大折弯应力为（273.524±50.680）N（图9）、B组最大折弯应力为（132.471±37.010）N（图10）、C组的最大折弯应力为（396.570±45.121）N（图11）。A组在8周时最大折弯应力高于B组。两组之间有显著性差异（＜0.01）。A组在8周时恢复到正常值的68.94%，B组恢复到正常值的33.33%，两组之间有显著性差异（＜0.01）。（图9-图11彩图见插页）

图9 A组最大折弯应力

图10 B组最大折弯应力

图11 C组最大折弯应力

3 讨论

本世纪50年代末60年代初，Ilizarov提出了牵张应力效应、环型外固定器与临床应用技术，使骨骼延长术得以广泛的应用，被誉为矫形外科的第4个里程碑[4]。虽然Ilizarov肢体延长术被称为是骨科治疗学上的一次革命，但由于其骨愈合较缓慢，并有较多的并发症。由于每天仅仅能以1.0mm左右的速度牵拉，加上延长区骨愈合时间，每延长1.0mm约需一两个月的时间，如延长5.0mm约需半年左右的时间[5]。因此，许多学者在促进骨愈合的机制和方法上进行了探索。Kassis[6]在延长结束后立即对延长区施加轴向微动刺激，观察到轴向微动刺激能增加骨痂体积、骨痂矿物质含量及密度，有利于骨愈合；Kitoh[7]应用自体骨髓干细胞植入延长区观察到明显的促进了骨愈合。徐鹏[8]等通过延长区注射rhBMP2观察到可明显促进延长区的骨修复。

上述方法虽有一定效果，作者对结果未能十分满意。既往的研究证实纳米羟基磷灰石有促进骨化和再生的能力[9]，而胶原是一种天然高分子材料，具有优异的生物相容性和生物活性[10]。本试验应用制备的液态Alg/nHAC，通过微创的方法将Alg/nHAC注射到兔子胫骨延长的动物模型延长区，分别从大体角度和组织学角度都观察到Alg/nHAC组新生成的骨痂明显多于对照组，从X线也见到Alg/nHAC组在不同时间段的延长区新形成的高密度均优于对照组。通过测定骨密度和生物力学检测也证实治疗组骨修复程度和强度均高于对照组，所以证实Alg/nHAC是有效的、理想的一种促进牵拉成骨愈合的新型材料。且Alg/nHAC可制备成液态通过注射微创的方法应用，具备创伤小恢复快的特点。Alg/nHAC促进牵拉成骨主要有以下两方面原因。一方面，纳米羟基磷灰石的微结构可以增加植入物的表面面积。这种结结构可以聚集更多的蛋白。这些蛋白可能包括骨诱导蛋白，可以通过影响细胞的黏附、增殖和分化促进成骨。另一方面胶原作为交联剂，它的螺旋形结构为组织的再生创造了最为合适的微环境。

为了促进骨愈合，近年来又有学者进行了很多研究[11,12]。随着现代医学的发展，微创理念逐步深入人心，在临床治疗中引入微创技术无疑有很好的前景。而延长区注射液态Alg/ nHAC可有效的促进牵拉成骨，并且创伤较小，有希望应用于临床，解决骨干截骨进行延长愈合差的难题，从而减少了骨干骺端固定困难、对邻近关节所致不良干扰等并发症。

[1]M.Kenawey,C Krettek,E Liodakis,et al.Leg lengthening using intramedullay skeletal kinetic distractor results of 57 consecutive applications[J].Injury,2011,42（2）:150-155.

[2]王明海，洪洋，甘少磊，等.血管化可注射性纳米组织工程骨对骨再生血管形成的影响[J].中华临床医师杂志（电子版），2013，7（13）：5948-5952.

[3]Xinhui Liu,Chao zhu,Yijiong Li,et al.The preparation and in vitro evaluations of a nanoscaled injectable bone repair material[J]. Journal of Nanomaterials,Volume 2015（2015）:858493.

[4]秦泗河.Ilizarov技术概述[J].中华骨科杂志，2006，26（9）：642-645.

[5]Kanellopoulos AD,Soucacos PN.Management of nonunion with distracetion osteogenesis[J].Injury,2006,37（1）:51-55

[6]KassisB,GlorionC,T abibW.Callusresponsetomicromovement after elongation in the rabbit[J].J Pediatr Ortho,1996,16（4）: 480485.

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[8]徐鹏，王丹辉，李长胜，等.重组人骨形态发生蛋白2局部注射促进兔胫骨延长区的骨愈合 [J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（32）:6335-6337.

[9]Y Deng,H Wang,L Zhang,et al.In situ synthesis and in vitro biocompatibility of needle-like nano-hydroxyapatite in agar-gelatinco hydrogel[J].Materials Letters,2013,104:8-12.

[10]YC Chiu,M H Cheng,S Uriel,et al.Materials for engineering vascularized adipose tissue[J].Journal of Tissue,2011,20（2）:37-48.

[11]X Li,H Liu,X Niu,et al.The use of carbon nanotubes to induce osteogenic differentiation of human adipose-derived MSCs in vitro and ectopic bone formation in vivo[J].Biomaterials,2012,33（19）:4818-4827.

[12]X Li,L Wang,Y Fan,et al.Nanostructured scaffolds for bone tissue engineering[J].Journalof Biomedical Materials Research A, 2013,101A（8）:2424-2435.

The experimental study on promoting the Ilizarov distraction osteogenesis by the injectiong of liquid Alg/nHAC biocomposites

Zhu Chao1,Wang Hua1,Liu Wei1,et al.
1 Department of Orthropaedics,Jiangning Hospital of Nanjing affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu,211100;2 Department of Material Science and Engineering,Tisinghua University,Beijing,10081,China

Objective To investigate the effect of liquid sodium alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)on promoting thehealingprocessof bonelengthening.Methods Alg/nHACinjectable artificialbone was fabricatedbyusing nano technology,and Animal model of rabbit tibia limbs,elongation were produced.All animals were randomly divided into two groups.After the end of the extension,liquid Alg/nHAC was injected into group A in the region of elongation. Group B were not given any treatment as control.Histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test were used to evaluate the bone healing of extention area at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Results Group A were better than Group B in histologically morphological observations,X-ray examination,biomechanical test,bone density,and biomechanical test at 2,4 and 8 weeks after termination of bone elongation.Group A bone elongation area has healed at 8 weeks after termination of bone elongation.Conclution Liquid alginate/nanohydroxyapatite/collagen(Alg/nHAC)can promote bone healing of extended area by minimally invasive injection.It provides a new method to promote bone healing in clinical.

Alg/nHAC; Ilizarov;Bone healing

R318

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.06.02

swgk2016-07-00167

朱超（1982-）男，硕士，主治医师。研究方向：骨科。

*[通讯作者]刘新辉（1971-）男，博士，主任医师。研究方向：骨科。

2016-07-20)

江苏省自然科学基金项目BK20141436

1南京医科大学附属南京江宁医院骨科，江苏南京211100；2清华大学材料科学与工程系北京100081