禽流感病毒宿主特异性与致病性的分子基础研究进展

张苗苗，许凯迪，陈鸿军，徐建青，闫大为，李泽君*，张晓燕*

(1.复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.四川农业大学，四川成都 611130)



禽流感病毒宿主特异性与致病性的分子基础研究进展

张苗苗1,2，许凯迪3，陈鸿军2，徐建青1，闫大为2，李泽君2*，张晓燕1*

(1.复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.四川农业大学，四川成都 611130)

摘要：禽流感病毒不断重排和变异导致新型流感病毒不断出现，其中有些毒株已经获得了感染哺乳动物的能力，严重危害人类公共卫生安全。近年来，对于禽流感病毒致宿主特异性和致病性的研究取得了一定进展。病毒蛋白某些氨基酸位点的突变就能够改变病毒的宿主特异性，使病毒能够跨宿主传播。而且，病毒的RNA聚合酶、NS1非结构蛋白和几种新发现的病毒蛋白都与病毒的致病性密切相关。论文阐述了禽流感病毒宿主特异性与致病性的分子基础，为禽流感跨物种传播机制研究及防控工作提供参考。

关键词：禽流感病毒；宿主特异性；致病性；病毒分子基础

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种传染病，天然宿主是禽类和鸟类。我国存在多种亚型禽流感病毒，不同亚型禽流感病毒的基因组重组频繁。近年来，不断产生新型禽流感病毒，能够直接跨物种传播到人类。1997年，香港暴发了高致病性H5N1禽流感病毒感染人并致6人死亡；2003年，荷兰暴发了H7N7禽流感病毒感染84人并致1人死亡；2004年，亚洲又暴发了高致病性H5N1禽流感，多个国家均发生了人感染并致死事件；近几年来，我国暴发了H7N9禽流感病毒感染人并致多人死亡事件，2013年底至2014年初，我国报道了3例H10N8禽流感病毒感染人事件，其中2人死亡。这些事件表明多种亚型禽流感病毒正在获得直接感染人的能力，成为威胁人类健康的重要病原。

1　宿主特异性分子基础

A型流感病毒具有一定宿主特异性，人体分离株不能在禽体内复制，禽源分离株在灵长类动物体内复制的能力也极低。这取决于细胞受体类型和HA基因上受体结合位点(receptor binding site，RBS)相互识别能力。人类上呼吸道气管上皮细胞上分布着大量的唾液酸α2,6-半乳糖苷(SAα2,6Gal)受体，人流感病毒优先识别并结合该受体，该受体又称为“人型”受体；禽类肠道上皮细胞上分布着大量的唾液酸α2,3-半乳糖苷(SAα2,3Gal)受体，禽流感病毒优先识别并结合该受体，该受体又称为“禽型”受体。

雪貂对人流感病毒非常易感，是研究流感病毒的最佳动物模型。H5N1流感病毒HA Q222L和G224S突变后，病毒宿主特异性发生改变，由“禽型”转为“人型”特异性受体[1]。研究发现2009 H1N1流感病毒的HA D222G突变后，病毒由原来的"人型"转为双重受体特异性[2]。随后研究发现H5N1流感病毒HA蛋白 N154D和T156A突变也可使病毒具有双重受体特异性，而H5N1流感病毒HA蛋白T156的突变可以同时增加病毒结合唾液酸α2,3-半乳糖苷和唾液酸α2,6-半乳糖苷的能力，从而增加病毒的空气传播能力[3]。Chen L M等[4]研究证实H5N1流感病毒HA蛋白Q222L/G224S和Q192R的改变可以改变病毒的受体特异性，从而增加病毒在雪貂中的空气传播能力。Herfst S等[5]通过H5N1流感病毒HA蛋白Q226L和G228S的改变，发现病毒能够通过呼吸道飞沫在雪貂模型中传播。这些研究说明HA基因的突变影响病毒受体结合特异性和空气传播的能力。

尽管HA蛋白在A型流感病毒感染宿主方面起决定性作用，但是宿主特异性是由多种因素决定的。研究发现，突变PB2蛋白的第627、 701、591位氨基酸能够引起宿主特异性的改变。禽流感病毒PB2蛋白E627K突变能够使病毒获得感染哺乳动物的能力，近几年发生的感染人类致死的H5N1、H7N9和H10N8禽流感病毒均发生了E627K突变。此外，Li Z等[6]首次发现禽流感病毒H5N1 PB2蛋白发生Q701N的改变能够使病毒跨越宿主传播。Chen Q等[7]也发现H5N1禽流感病毒PB2蛋白发生D701N突变后，获得了感染豚鼠的能力。禽流感病毒H5N2 PB2蛋白E627K和Q591K突变能够改变宿宿主特异性，使得病毒获得感染哺乳动物的能力。Yamaji R等[8]证实H5N1禽流感病毒PB2蛋白E249G、G309D和T339M突变能够增加病毒在A549细胞中的复制能力，说明这几个位点氨基酸的突变有助于H5N1禽流感病毒对人肺细胞的适应性。Sutton T等[9]发现H7N1流感病毒PB2蛋白T81I、NP蛋白V284M、M1蛋白R95K以及 M1蛋白Q211K这几个氨基酸位点的突变能够使病毒通过空气在雪貂中传播。Song J等[10]研究发现H5N1流感病毒PA蛋白S224P和N383D突变与病毒的哺乳动物适应性相关，这2个位点的突变增强了病毒在禽类和人类细胞中的聚合酶活性，提高了病毒对小鼠的致病性。Chen Q等[11]发现H7N7禽流感病毒小鼠传代适应株的几个氨基酸发生了改变，即PB2蛋白E627K、PB1蛋白R118I、PA蛋白L550M、HA蛋白G214R、NA蛋白S372N，研究证实这些位点的突变使病毒在哺乳动物细胞中复制，并增强了对小鼠的致病性。也有研究发现禽流感病毒NS基因A374G突变与病毒跨越宿主障碍在人、猪和犬之间的传播有很大的关系。该位点的突变与1997年H5N1禽流感病毒和1999年H9N2禽流感病毒跨宿主传播人类有关[12]。

2　致病性分子基础

2.1聚合酶蛋白对流感病毒致病性的作用

流感病毒的RNA聚合酶由PB2蛋白、PB1蛋白和PA蛋白3个亚单位组成。PB2蛋白不仅与病毒宿主特异性相关，而且还与病毒的致病性有关。Linster发现H5N1流感病毒PB2蛋白E627K和PB1蛋白H99Y突变增强了聚合酶活性，使得病毒在MDCK细胞上的复制能力增强[3]。Yamada S等[13]发现H5N1禽流感病毒Q591K的突变直接改变了PB2蛋白的结构，从而影响PB2蛋白与病毒和细胞受体的相互作用，进而大大增强了病毒对小鼠的致死能力。

研究发现，入核转运蛋白α主要与流感病毒的复制有关，其主要与流感病毒聚合酶蛋白进行结合，介导该类蛋白的入核转运过程。PB2蛋白D701N突变也可以通过促进PB2聚合酶蛋白上核定位信号的暴露来增加病毒PB2蛋白与入核转运蛋白α之间的结合，从而增强流感病毒的复制能力。研究发现，H7N7禽流感病毒PB2蛋白D701N、S714R和PA蛋白K615N氨基酸改变后，在哺乳动物细胞上的复制效率显著提高，而在禽类细胞上的复制效率则显著下降，而且对小鼠的致病性也显著提高，PB2蛋白D701N突变也会影响病毒的传播性，PB2蛋白第701位氨基酸为Gln是该病毒能够在豚鼠间进行有效传播的前提条件[14]。

PB1蛋白是RNA聚合酶的催化中心。PB1蛋白可与模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)发生特异性结合。PB1蛋白主要定位于细胞的内质网膜上，而且在不同细胞中的表达量存在很大差异，体外研究证明该蛋白为流感病毒复制所必需。研究发现 2009 H1N1流感病毒 PB1蛋白T296R氨基酸突变能够增强病毒聚合酶活性，从而增强病毒对哺乳动物的致病性[15]。PB1蛋白第622位影响H5N1禽流感病毒对小鼠的致病性，PB1蛋白G622D突变能够减弱PB1蛋白与病毒RNA的结合，降低聚合酶活性，减弱病毒对小鼠的致病性[16]。

PA蛋白是磷酸化蛋白，其N端是聚合酶的多功能区，可调控蛋白的稳定性、活化核酸内切酶活性、结合帽子和启动子结构，并且对聚合酶的结构起重要作用，此区的基因突变会导致宿主蛋白降解。研究发现，H5N1禽流感病毒PA蛋白第185位氨基酸为Lys，则病毒在体内和体外的复制能力减弱，将其突变为Arg后，则显著增强了病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性和病毒毒力，增强了病毒对小鼠的致病性[17]。H7N9禽流感病毒PA蛋白S409N突变能够增强病毒的聚合酶活性，提高病毒对小鼠的致病性[18]。

2.2非结构蛋白NS1对禽流感病毒致病性的影响

NS1是禽流感病毒非结构蛋白，与病毒的毒力和致病性相关。研究发现位于NS1蛋白RNA结合域的第42位氨基酸对H5N1禽流感病毒在哺乳动物体内的毒力有重要作用，将H5N1禽流感病毒NS1蛋白第42位氨基酸由Pro突变为Ser后，其对小鼠具有了高致病性，进一步研究发现NS1蛋白第42位氨基酸对病毒抑制双链RNA对NF-κB和IRF-3途径的激活起关键作用。将NS1蛋白第38和41位氨基酸单独突变为Ala时，不能改变病毒对小鼠的高致病性，而将这2个位点同时突变为Ala,病毒在小鼠体内则完全致弱[19]。Long J X等[20]将H5N1流感病毒NS1蛋白第80-84位氨基酸缺失后，发现病毒的毒力得到了增强，进一步研究发现，NS1蛋白这5个氨基酸的缺失影响了TNF-α水平，而且NS1-92E氨基酸突变能够调节IFN水平。Ayllon J等[21]将H7N9流感病毒NS1蛋白I106M突变后，病毒毒力增强。

2.3新发现的几种蛋白对流感病毒致病性的影响

PB1-F2蛋白是PB1+1可读框编码的87个残基的蛋白，该蛋白在感染细胞的线粒体内大量存在。PB1-F2蛋白能够诱导细胞凋亡，是流感病毒的一个重要的毒力因子。H5N1流感病毒和1918年H1N1流感病毒中PB1-F2蛋白第66位氨基酸发生突变(N66S)能够使病毒炎性细胞因子分泌增加,并大大增强病毒的毒力和致病性[22]。

PB1-N40蛋白是PB1蛋白N末端截短后的蛋白。PB1-N40蛋白对病毒的组织培养和鸡胚增殖是非必需的蛋白。PB1、PB1-F2和PB1-N40蛋白的表达是相互依赖的，PB1-N40蛋白的一个重要作用就是维持PB1蛋白与PB1-F2蛋白表达量的平衡。去除PB1-F2蛋白的起始密码子会导致感染初期PB1-N40蛋白的表达过量，而PB1蛋白表达延迟。截短PB1-F2蛋白8个密码子后，由于破坏了PB1-N40蛋白的AUG起始密码子，所以不再表达PB1-N40蛋白。PB1-N40蛋白的AUG密码子发生突变会导致PB1蛋白的表达量增加3倍[23]。PB1-N40蛋白还能够影响流感病毒的复制效率。Tauber S等[24]研究发现，病毒缺失PB1-N40蛋白会降低聚合酶活性，从而减慢病毒的复制速率。

PA-X、PA-N155和PA-N182蛋白都是由PA基因编码而来。PA-X蛋白调节宿主对流感病毒感染的应答反应。PA-X蛋白的N端核酸内切酶区能够调节宿主mRNA的降解，但是其作用底物和特异性还不确定[25]。PA-X蛋白具有阻断宿主细胞的作用，它能够通过抑制宿主细胞内基因的表达来减弱宿主细胞的抗病毒反应，并介导核糖体对病毒mRNA的转录。研究发现，流感病毒野毒和PA-X蛋白缺失毒感染小鼠后，小鼠体内的应答反应截然不同，PA-X蛋白缺失毒株感染的小鼠体内许多基因得到上调。分析发现，这些基因主要与免疫应答(IFN-γ、趋化因子受体CCR5、CD28、IL-7和IL-15信号)、细胞凋亡(Fas通路信号、淋巴毒素)和细胞分化有关。PA-X蛋白缺失毒株能够加速宿主细胞的抗病毒反应，从而导致感染的小鼠出现更为严重的临床症状[25]。PA-N155和PA-N182蛋白是PA蛋白N端截短后的蛋白。A型流感病毒感染不同宿主细胞，均能检测到PA-N155和PA-N182蛋白的表达。PA-N155和PA-N182蛋白与病毒的致病性有关，Muramoto Y等[26]将表达PA-N155和PA-N182蛋白的第155和182位起始密码子AUG(Met)突变为CUA(Leu)，从而抑制这2种蛋白的表达。研究发现第155位突变病毒和第155与182双位点突变的病毒，不但能够降低病毒在细胞中的复制速率，而且还能够减小病毒对小鼠的致病性。

最新研究发现H5N1禽流感病毒NA蛋白(S269D、E41H)、NS1蛋白(S48N、K212N)、M1蛋白(V166A)、M2蛋白(G14E)、NP蛋白(Q48P)以及PB1-F2蛋白(Q48P)等氨基酸位点的突变与病毒的致病性由低转高相关[27]。

综上所述，流感病毒的宿主特异性和致病性是多因素相互作用的结果，其不仅与病毒本身有关，而且宿主因素也起到非常重要的作用。因此，对病毒宿主范围和致病性分子基础进行深入的研究，不仅有助于了解病毒的致病机理，还能准确掌握病毒的变异方向，为预测具有潜在流行性的毒株奠定基础。

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收稿日期：2015-12-23

基金项目：国家自然科学基金项目(31472206)

作者简介：张苗苗(1988-)，女，陕西宝鸡人，博士研究生，主要从事病原生物学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.659.5

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0102-04

Progress on Molecular Basis of Host Specificity and Pathogenicity of Avian Influenza Viruses

ZHANG Miao-miao1，2,XU Kai-di3,CHEN Hong-jun2,XU Jian-qing1,YAN Da-wei2,LI Ze-jun2,ZHANG Xiao-yan1

(1.ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,FudanUniversity，Shanghai，201508,China；2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai，200241,China；3.SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu，Sichuan，611130，China)

Abstract:Because of the reassortment and mutant,many new avian influenza viruses emerged in these years and several strains have gained the ability to infect mammals,which posed great harm to public health and safety.In recent years,the studies of host specificity and pathogenicity of avian influenza viruses made great progress.Mutation of certain amino acids of virus proteins will be able to change host specificity and enable viruses to spread across different hosts.Moreover,the viral RNA polymerase proteins,NS1 non-structural protein and several newly discovered virus proteins are closely related to virus pathogenicity.This paper described the molecular basis of host specificity and pathogenicity of avian influenza viruses,which provided an important theoretical basis for cross-species mechanism study and prevention and control of the influenza viruses.

Key words:Avian influenza virus; host specificity; pathogenicity; molecular basis