探析高产丁醇菌种的选育及代谢副产物对丁醇发酵的影响

汪江林

摘 要：采用实验的方法探析了高产丁醇菌种的选育及其代谢副产物对丁醇发酵的影响，以供相关单位参考。

关键词：高产丁醇菌种；代谢副产物；汽油；能量密度

中图分类号：TQ923 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2016.03.124

丁醇是重要的有机溶剂，在化工、医药、材料和印染等行业有非常广泛的应用。由于石油、煤炭等资源引发的环境问题、能源问题越来越严重，全世界都在寻求一种能代替化石燃料，并能降低CO2排放的新型能源。而生物丁醇作为典型的生物质能源，可以与汽油混合使用，具有与汽油配伍性良好、能量密度高等众多优点，受到了社会各界的高度重视。高产丁醇菌种能利用非粮食类原料生产丁醇，这样能有效降低生产成本，因此，高产丁醇菌种的选育已成为国内外研究人员探索和研究的重点。

1 实验部分

1.1 菌种来源

实验采用的丁醇菌种为某地郊区树下的深层土壤。

1.2 主要仪器设备

实验采用的仪器设备包括7683B气相色谱仪、电子秤、光学显微镜、试管、滴定管、离心管、冷凝管、恒温水浴锅、电子恒伟电热套、可见光分光光度计、电磁炉、培养箱、干燥箱、酸度计、台式冷冻离心机、恒温振荡器和高压蒸汽灭菌锅等。

1.3 配置培养基

高产丁醇菌种的培养基包括以下3种：①富集培养基。采用电子秤称量65 g的玉米粉，加入1 500 mL的烧杯中煮沸呈糊状，糊状物剩1 000 mL时通入氮气，并分别装入100 mL的厌氧瓶中。②分离培养基。在固体滚管中加入质量浓度为15 g/L的琼脂、质量浓度为2.0 g/L的蛋白胨、质量浓度为0.5 g/L的磷酸氢二钾、质量浓度为1.0 g/L的氯化钠、质量浓度为0.2 g/L的七水合硫酸镁、20 g的葡萄糖。③发酵培养基。发酵培养基的成分为体积分数为1.0 mL/L的维生素溶液、质量浓度为3.0 g/L的酵母提取物、质量浓度为0.4 g/L的七水合硫酸镁、质量浓度为1.5 g/L的氯化铵、2.7 g的磷酸二氢钾、质量浓度为65 g/L的葡萄糖、质量浓度为0.5 g/L的半胱氨酸。

1.4 实验方法

1.4.1 高产丁醇菌种的富集和筛选

在持续通氮的条件下，将土壤放入厌氧培养瓶中并振荡，直至土壤中的芽孢全部释放；取上清液煮沸，将活体细胞全部杀死，用注射器吸取10 mL的上清液，移入富集培养基中培养，静置5 d左右；将静置后的上清液加入新的富集培养基中，反复3次；当菌群覆盖培养瓶时，表明菌群生长良好，选取1 mL上清液加入分离培养基中，静置2 d；缓慢地沿一个方向转动试管，使菌液均匀的铺在培养基上，静置2 d；用氮气针挑取生长良好的单菌落加入液体培养基中，并通过显微镜观察菌体的形态。

1.4.2 高产丁醇菌种的鉴定

高产丁醇菌种的鉴定可采取以下2种方法：①形态学观察和鉴定。在光学显微镜下观察菌体形态，呈梭状为合格。②分子生物学鉴定。取对数期的菌液3 mL，离心5 min，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，以16S rDNA为引物进行基因扩增，并回收和纯化细菌16S rDNA；以pMD18-T为转化载体，在室温条件下反应2 h，然后加入100 μL的感受态细胞T1中，并在42 ℃的水浴中加热50 s后迅速放入冰水浴中冷却；添加250 μL的培养基，培养1 h；添加Amp，培养30 min；当X-gal和IPTG吸收完毕后，取150 μL的菌液培养，培养时间必须<12 h；通过琼脂糖凝胶电泳检测选，取呈阳性的菌液，并在具有相应资质的实验室测序。

2 代谢副产物对丁醇发酵的影响分析

代谢副产物对丁醇发酵的影响分析分为以下3步：①当实验人员发现编号为S12的菌株的丁醇生产能力最优秀时，利用分子鉴定手段对菌株S12进行了鉴定，并在此基础上，通过相应的序列比对确定了S12的菌类。②实验人员在确定最佳时间的过程中，合理结合形态学的观察方法发现，丁醇的质量浓度为5.212 g/L，相比于优化前的 5.017 g/L，这一产量提升在第16小时最明显；在培养基成分中，七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖对菌株S12的产丁醇发酵有明显的影响。通过菌株S12的生长曲线测定可得到相应的理想时间点。实验发现，七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖的最适添加质量浓度分别为0.39 g/L、2.7 g/L和64.69 g/L。实验结束后，丁醇的产量达到了4.21 g/L，比原产量提高了3.5%.③实验人员通过在不同细菌生长期添加有机酸，确定了菌株S12接受代谢副产物调控的最佳时间为对数期末期，且在这一过程中，可利用响应面来分析不同因素对丁醇生产的影响。丁酸对丁醇的促进能力比乙酸高。实验结果表明，丁醇的最终产量为5.808 g/L，比以往提升了38.24%.

3 结论

综上所述，丁醇作为一种重要的化学工业原料，得到了广泛应用。丁醇发酵的相关研究对丁醇的进一步应用有着极为重要的意义。因此，技术人员应对丁醇菌种的选育及其代谢副产物对丁醇发酵的影响有清晰的了解，从而使丁醇在未来得到更加合理的应用。

本文以某地区树下深层土壤的丁醇菌种为实验材料，通过实验发现，编号为S12的菌株生产丁醇的能力最强，并通过形态学观察、分子生物学鉴定的方法，将S12作为一种菌种，用于丁醇的高效发酵和生产。在培养基中添加七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖对丁醇发酵的影响比较明显，可提高丁醇的产量。此外，复合有机酸对丁醇的发酵有一定的影响，且乙酸的促进能力低于丁酸，添加合适浓度的丁酸能提高丁醇的产量。

参考文献

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〔编辑：张思楠〕