饮用水中未知细菌鉴定方法研究进展

滕凡全，田英，赵明义，田艳秋

（1.辽宁省水文局，辽宁 沈阳 110000；2.辽宁省沈阳市儿童医院输血科，辽宁 沈阳 110000；3.辽宁大学生命科学学院，辽宁沈阳110000）



饮用水中未知细菌鉴定方法研究进展

滕凡全1，田英1，赵明义2，田艳秋3

（1.辽宁省水文局，辽宁 沈阳 110000；2.辽宁省沈阳市儿童医院输血科，辽宁 沈阳 110000；3.辽宁大学生命科学学院，辽宁沈阳110000）

［摘 要］世界卫生组织（WHO）《饮用水水质准则》指出，与饮用水有关的卫生问题大多来自微生物的污染，且饮用水受到微生物污染是全世界普遍存在的问题。因此，严格监测饮用水微生物污染，对保障人民群众身体健康具有重要现实意义。文中主要综述了饮用水中未知细菌的多种鉴定方法的研究进展，对几种鉴定方法的优缺点进行比较。

［关键词］饮用水；细菌；鉴定方法

据联合国有关统计数字[1]，目前全球有17亿人喝不到干净的饮用水，每天约有2.5万人因水质低劣而死亡。饮用水水质的好坏直接决定人们的健康。环境中微生物尤其是细菌污染严重威胁着人类的健康，快速鉴定环境中的致病微生物对于控制传染病的爆发和传染病的监测极为重要。近20年来，一些环境中非常见的致病菌(包括条件致病菌)感染引起腹泻的事件时有发生，军团菌感染引起的肺炎也引起人们的广泛关注。在饮用水中不断发现新的对人类造成重大危害的病原微生物，如大肠杆菌O157:H7、军团菌、隐孢子虫、柯萨奇病毒等[2-4]，常规饮用水处理技术难以有效地去除。由于环境污染加剧，还会产生一些新的病原微生物，危害人类健康。因此寻找快速鉴定饮用水中未知细菌的方法，对保障饮用水安全具有重要现实意义和应用意义。现阶段对于饮用水样品的鉴定主要还是依赖于传统的培养特性、生化反应等技术。随着生物学技术的飞速发展，细菌的分类鉴定发生了重大革新，开始进入分子水平，一批新的细菌鉴定方法也随之产生。现将饮用水中细菌的鉴定方法进行分类介绍：

1　表型鉴定法

1.1常规形态学观察

通过常规宏观菌落形态学观察，如细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色等特征；在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜等状况；半固体培养基上穿刺接种后生长状态等；在鉴别培养基上培养，观察结果是否跟预期结果相同。

1.2染色方法鉴定

染色方法鉴定细菌为细菌的个体形态学观察，主要包括：①单染色法：用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。②复染色法：用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。③荧光染色法：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在细菌鉴定中有很大的实用价值。

1.3生化鉴定

根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物，表现出不同的生长特性。通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否，从而能够得到细菌的鉴定结果。如糖（醇）类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等。

传统的手工生化鉴定存在耗时长，人为因素影响大，随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，近年来微生物的检测鉴定技术，已逐步由传统的手工检测鉴定进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段，并力求快速、简便、准确。一系列商品化全自动/半自动生化鉴定系统相继推出，并在应用中取得了比较理想的效果，如美国Biolog公司的 BIOLOG系统和法国梅里埃公司的VITEK系统。目前市场上的微生物自动鉴定系统虽然基本上都通过了相关权威组织的认可，在细菌快速鉴定或初步鉴定中起到了一定的作用，但如前所述，其稳定性尚存在一定问题，同样需要配合其他方法来相互印证，从而更精确、快速地完成细菌鉴定工作。

2　以抗原抗体反应为基础的鉴定技术

这类技术包括：乳胶凝集反应、ELISA方法、胶体金技术、免疫磁珠法以及细菌鉴定经典方法—血清型鉴定等。以血清型鉴定为例，它是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法。抗原的特异性程度又存在于属间细菌所共有的共同抗原，这种抗原的存在，能表明其属性。通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定。该方法有一定的局限性，只能对细菌抗原大分子表面构型进行分析比较，受抗原空间构型的限制无法深入分析。

3　以核酸检测为基础的鉴定技术

3.1 16SrDNA序列鉴定

近年来，16SrDNA被用来作为细菌鉴定分类的重要依据，而且应用越来越广泛[5]。16SrDNA基因序列长约1.6kb左右，存在于原核生物中。它由保守区和可变区组成，保守区为所有细菌所共有，细菌间没有差别；可变区在不同细菌之间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性。细菌的16SrDNA序列变化速度与进化速率相适应，因此被广泛用于种属鉴定。结合完善的数据库，16SrDNA序列分析可以快速准确的对微生物进行种属鉴定，确定微生物在进化中的位置。根据16SrDNA序列同源性分析建立细菌系统发育分类的准确性和重要性已经被越来越多的细菌分类学者所认识和接受。

3.2指纹图谱技术

利用重复性DNA序列之间距离不同(repeat-PCR)，通过对它的扩增，产生不同大小的DNA片段来代表这些重复性DNA间的不同距离。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳产生特异性DNA指纹。许多拷贝的基因外重复序列，如重复性基因外回纹结构(REP)和肠杆菌重复性基因内共有序列(ERIC)，都存在于许多菌种中，将染色体DNA和以REP为基础的探针杂交，可区分肠杆菌种和大肠杆菌分离物[6]。尽管PCR技术以其明显的优势在细菌分类鉴定中起到了巨大作用,但也有一定缺点，主要是引起一定程度的单核苷酸的错误掺入，而且微量的外源DNA进入PCR，引起的无限放大可产生假阳性结果。

3.3质粒图谱分析法

质粒图谱分析就是将质粒从每个分离物中提取出来,在琼脂糖凝胶上作分离电泳，检测它们的大小与数量，还可进一步用限制性核酸内切酶消化质粒，然后比较酶切片段的大小与数量,通过此种方法可提高质粒图谱分析的分辨力[7]。该技术有一定缺点，如适用范围窄，只适于存在质粒的细菌，无法用于不含质粒的细菌；有些质粒不稳定；限于一定时间和地区范围内；需要保存在-70℃；如纯化不净，质粒和染色体DNA条带容易相互混淆，影响实验结果。

3.4基因探针技术

具有同源序列的两条DNA单链或DNA与RNA单链，在适当的条件下能互补地形成稳定的DNA双链或DNA-RNA链，随着Southern印迹技术的出现，用标记的带有高度特异性DNA限制性同源基因位点的DNA，探针可识别具有同源序列的限制性片段，从而降低片段长度多态性所要分析的条带数量。所有携带与探针一样的同源基因位点的细菌菌株都可得到分离，结果具有很高的重复性。目前常用的杂交探针包括随机克隆的染色体DNA序列、抗性基因、毒素基因、rRNA基因及其它一些基因。以前该法还受到探针放射性标记的限制，但随着非放射性标记方法的产生，特别是生物素地高辛标记探针的产生和商品化，该法得到了广泛应用。杂交后经放射自显影或生物素地高辛显色，可利用特异性DNA条带和指纹图对细菌进行分类鉴定，而且可通过对它们之间的同源性比较进一步了解菌株间的亲缘关系。

3.5 DNA GC含量

染色体DNA的GC含量即DNA的碱基组成。由于不受菌龄的影响，已成为细菌分类鉴定的重要指标。每一种生物的DNA均有特定的GC含量，不同生物各不相同，生物种间亲缘关系较近，则GC含量差别较小，反之亦然。DNA的GC含量测定方法主要有纸层析法，浮力密度法，高效液相色谱法，热变性温度测定法（Tm法）和荧光法等，由于Tm法操作简便、精确度高、重复性好，被广为采用。

4　基于蛋白质图谱分析的鉴定技术

蛋白质图谱鉴定细菌主要是基于图谱中存在细菌蛋白质标志物，其含量和结构具有种属特异性，能够标志某一类或某种特定细菌的存在。近年来，基于蛋白质组学的质谱技术凭借其高灵敏度、高通量、快速等特点，在细菌检测及鉴定方面得到快速发展。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是近几年快速发展起来的应用于细菌全细胞快速检测的一项技术。此种技术的应用与其它细菌检测技术相比,具有明显的优势：所需时间短；可在细菌的种、株水平上将细菌区分开来；产生质谱图的生物标记物来源于细菌表面，有利于对不同血清型菌株的鉴别。但在应用MALDI-TOF-MS的过程中，很多因素会对质谱图产生影响，如有些细菌需要特殊的培养基才能正常生长，培养基的选择会影响检测结果。另外，该技术所使用的仪器价格昂贵，仪器使用成本高等缺点，需要专业人才才能使用，不易普及应用。

5　结语

综上所述，每种鉴定方法均有其优点和缺陷，因此为了准确地对饮用水中未知细菌进行鉴定，应该把表型鉴定和基因鉴定方法结合起来。PCR技术、显微荧光技术、免疫组化技术往往需要较长的时间和复杂的前处理程序，鉴定实验要求较高，不利于细菌的快速检测。16SrDNA序列鉴定方法操作简单，具有高灵敏度和高特异性，BIOLOG快速鉴定方法快速、准确，两者结合可以达到快速、准确鉴定饮用水中细菌的要求。另外，在鉴定饮用水中未知细菌的过程中，还要注意特殊细菌（如耐氯细菌等）的生理特性。在日常工作中充分利用和完善现有鉴定技术，研究和对比新的鉴定方法，寻找在灵敏性、特异性和实用性上更适合饮用水中细菌快速鉴定需要的方法，更大程度地满足饮用水安全控制的迫切需求，保障人民群众的用水安全和健康。总而言之，更多地使用传统与现代相结合以及不断发掘新的鉴定方法才能寻找到更简便、快速、准确、灵敏并且成本低廉的检测方法，更好地完成饮用水中细菌快速鉴定工作。

［参考文献］

［1］Ji Chang.Membrane Bioprocesses for the denitrification of drinkingwatersupplies.Journalofmembranesciences，1993，80：233-239.

［2］Wang ZJ，He XQ，Xie XM.Moleculartechnologies for monitoring pathogens in drinkingwater.J Ecotech Res，2004，10（3）：113-1181.

［3］王晓昌.隐孢子虫-水系传染疾病寄生虫［J］.中国给水排水，1996，12（4）：43-441.

［4］严敏，陈红英.病原微生物和水处理［J］.浙江工业大学学报，2004，32（3）：338-342.

［5］AmannRI，Ludwig W，SchleiferKH，et al.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbial Rev，1995，59（1）：143 -69.

［6］Vresalovic J，et al.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes.Nucleic Acid Res，1991，19：6823-6831.

［7］Coia JE，et al.Plasmid profiles and restriction enzyme fragmentation patterns of plasmids of methicillin-sensitive andmethicillin-resistantisolatesofStaphylococcusaureusfrom hospital and the community.J Med Microbiol，1988，26：189-197.

[项目资助]沈阳市科技局计划项目（F13-316-1-63），辽宁省教育厅一般项目（L2015201）

［中图分类号］X832

［文献标识码］C

［文章编号］1002－0624（2016）05－0044－03

[收稿日期]2016-03-05