香豆素类化合物清除自由基及抗肿瘤活性研究

张娜，陈文娟，柳青青，周玥，钟儒刚（北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124）



香豆素类化合物清除自由基及抗肿瘤活性研究

张娜，陈文娟，柳青青，周玥，钟儒刚
（北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124）

摘要：运用电子顺磁共振（EPR）和细胞增殖检测试剂盒（MTS）两种方法研究4个双羟基香豆素化合物及天然产物VC的清除DPPH自由基及抗肿瘤细胞增殖的能力。结果表明，香豆素化合物清除DPPH自由基EC50值和抗肿瘤细胞增殖活性IC50值的范围分别为9.04 μmol/L~37.32 μmol/L和21.76 μmol/L~38.48 μmol/L，均优于VC自由基清除能力（EC50为42.44μmol/L）和抗肿瘤细胞增殖能力（IC50为>100 μmol/L）。其中，化合物1a的清除自由能力最强（EC50为9.04 μmol/L），化合物2b的抗肿瘤活性最高（IC50为21.76 μmol/L）。因此，与VC相比，4个双羟基类化合物表现出较强的自由基清除能力和抗肿瘤细胞增殖活性，为具有癌症防治功能的天然产物抗氧化剂的开发利用提供理论基础和试验依据。

关键词：香豆素；自由基清除能力；抗肿瘤活性；EPR；MTS

癌症是当前严重威胁人类生命的最主要的疾病之一，而人体内过量的自由基可导致细胞和组织器官的损伤，进而诱发癌症及心血管功能障碍等多种疾病[1-2]，摄入外源性的抗氧化剂可以在生理上和药理水平上有效降低或预防癌症的发生[3]。研究表明，作为抗氧化剂的天然产物如白藜芦醇、大豆异黄酮和黄芩素可诱导癌细胞的死亡[4]。因此，兼具自由基清除活性且抗肿瘤活性的抗氧化剂成为癌症防治的重要来源。

香豆素是一类广泛分布于伞形科和芸香科植物中的苯并呲喃酮衍生物，具有抗菌、消炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性[5]，已被认定为重要的药物先导化合物。相关文献表明，香豆素类化合物通过控制血糖和血脂，抑制过氧自由基功效，抑制脂氧合酶和环氧合酶花生四烯酸的代谢途径而发挥其抗氧化性功效[6-7]；同时，该类化合物在体内是一类重要的抗癌物质，对人类肺癌，肾癌及乳腺癌细胞线粒体具有显著的抗增殖活性，也可通过抑制细胞中Cyclin D1的过量表达来抑制癌细胞增殖[8]。因此，香豆素所具有的多种药理作用，如神经保护、抗肿瘤、抗炎作用等均与其抗氧化活性有关[9-10]。本研究选择4-甲基及4-三氟甲基取代的双羟基香豆素类化合物（如图1所示），分别是来源于木犀科植物苦枥白蜡树的七叶亭（6，7-二羟基香豆素），及瑞香属植物长白瑞香的瑞香素（7，8-二羟基香豆素）的衍生物，采用电子顺磁共振方法（EPR）及细胞增殖试剂盒（MTS）测定化合物清除DPPH自由基的能力及抗肿瘤细胞增殖活性，以探究两类化合物的清除自由基能力及抗肿瘤活性，为具有癌症防治功能的天然产物抗氧化剂的开发利用提供理论基础和试验依据。

图1香豆素化合物的化学结构式Fig.1 The chemical structure of coumarins

1材料与方法

1.1材料与仪器

6，7-二羟基-4-甲基香豆素（1a）、7，8-二羟基-4-甲基香豆素（1b）：百灵威公司；6，7-二羟基-4-三氟甲基香豆素（2a）、7，8-二羟基-4-三氟甲基香豆素（2b）：以1，2，4-苯三酚，1，2，3-苯三酚及三氟乙酰乙酸乙酯为原料：北京工业大学分析测试中心自制[11]；2，2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）：美国Sigma公司；无水甲醇（一级色谱纯）：天津四友精细化学品有限公司；MTS试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司；人肺癌细胞A549细胞株：上海华瑞生物科技有限公司。

A-300电子顺磁共振仪：德国Bruker公司；EnSpire酶标仪：美国PerkinElmer公司。

1.2方法

1.2.1化合物溶液配置

香豆素溶液配制：分别准确称取0.0096g化合物1a 与1b和0.0123g化合物2a与2b，使用无水甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成浓度为1 mmol/L储备液。

VC溶液配制：准确称取0.008 8 g VC，使用去离子水溶解并定容于50 mL容量瓶，配制成浓度为1 mmol/L储备液。使用去离子水将溶液稀释为20、40、60、80、100、120、140 μmol/L的使用液。

DPPH溶液配制：准确称取DPPH固体粉末0.071 0 g，用无水甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶，配制成1.80 mmol/L DPPH储备液，冷藏避光保存。准确移取5 mL储备液于50 mL容量瓶，用无水甲醇定容至刻度，配制成0.180 mmol/L DPPH使用液，使用液需现用现配。

1.2.2 DPPH自由基清除能力测定

使用无水甲醇将1 mmol/L储备液稀释为0、5、10、20、40、60、80、100 μmol/L的使用液。取不同浓度的香豆素化合物按照表1进行加样，反应30 min后用50 μL毛细管吸取一定量反应混合液装入保护管，置于谐振腔中进行测试[12]。EPR仪器所采用的参数为：中心磁场3 524.970 G；扫场宽度200.000 G；微波频率9.842 GHz；微波功率20.17 mW；调制频100 kHz；调制幅度2.00 G。以谱图中3 507 G处峰高表示DPPH自由基的强度，按公式1计算化合物对DPPH自由基的清除率。

表1 EPR试验加样表Table 1 Sample composition for EPR experiment

式中：I1为未加化合物时DPPH原始信号强度，使用无水甲醇代替样品液；I2为加入化合物后DPPH的信号强度。

1.2.3抗肿瘤细胞增殖活性测定

使用RPMI1640培养基将1 mmol/L储备液稀释为10、20、40、60、80、100、120、240 μmol/L的待测液。将处于对数生长期的肺癌细胞配成细胞悬液，以每孔7 500个细胞的量接种到96孔板内。在37℃，5 % CO2条件下孵育培养24 h，设置阴性对照3孔，将含有不同浓度的香豆素化合物的待测液处理A549细胞24 h。药物作用24 h后，每孔加入10 μL MTS试剂，继续培养2 h，终止培养，用酶标仪在450 nm波长下测定其吸光度值，并按公式2计算化合物对肺癌细胞A549的增殖抑制率绘制曲线。

式中：D1为未加待测物时的OD值，使用培养基代替样品液；D2为加入待测物时的OD值。

2结果与分析

2.1香豆素化合物及VC清除DPPH自由基的能力

运用EPR方法对不同浓度的化合物及VC进行测试。以磁场强度为横坐标，信号强度为纵坐标绘制化合物清除DPPH自由基的电子顺磁共振波谱图。以化合物1a和VC为例，如图2所示。

图2不同浓度的化合物1a及VC清除DPPH自由基的电子顺磁共振波谱图Fig.2 EPR signals of DPPH radicals scavenging for the different concentrations of compound 1a and VC

由图2可知，DPPH自由基特征峰中心磁场均在3 507 G，自由基波谱信号强度均随化合物浓度的增加而显著减小，说明化合物的浓度越大对DPPH自由基的清除作用越强。进一步分析可知，化合物1a在浓度大于20 μmol/L后信号锐减，浓度为60 μmol/L时信号强度趋于零，说明化合物1a对DPPH自由基的清除能力较强。

香豆素化合物的清除自由基能力通过自由基清除率的EC50值体现，EC50值越小，则清除能力越高。以DPPH自由基清除率（%）对化合物浓度（μmol/L）作图，见图3。

图3香豆素化合物及VC对DPPH自由基的清除率与浓度关系Fig.3 The correlation between DPPH radical scavenging rate and concentrations of coumarins and VC

由图3可知，在一定浓度范围内，DPPH自由基清除率随浓度化合物的增加而逐渐升高。化合物1a与化合物1b，2a，2b分别在0~20 μmol/L和0~40 μmol/L内，清除率显著升高，60 μmol/L的化合物1a与 80 μmol/L的化合物1b，2a，2b自由基清除效果相当，且清除率接近100 %。这与波谱图的变化趋势是一致的。结果通过计算得出：4种香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）及VC清除DPPH自由基的EC50值（DPPH起始强度减少50 %时所对应的清除剂浓度）分别为：9.04、37.32、34.60、29.33、42.44 μmol/L，清除能力依次为：化合物1a> 2b> 2a> 1b>VC。说明4种香豆素类化合物清除DPPH自由基的能力优于天然抗氧化剂VC。

2.2香豆素化合物及VC抑制A549细胞的增殖能力

运用MTS方法，对不同浓度的4个化合物及VC进行抗肿瘤细胞A549增殖活性测试。以增殖抑制率（%）对化合物浓度（μmol/L）作图，见图4。

图4化合物对肿瘤细胞A549增殖的抑制率与浓度的关系Fig.4 The correlation between A549 cell proliferation inhibitory rate and concentrations of coumarins

由图4可知，不同的香豆素衍生物作用于A549细胞24 h后，对A549细胞均有不同程度的抑制作用，且随着香豆素衍生物浓度的增加，其增殖抑制率也在逐渐上升，说明化合物的浓度越大对A549细胞的增值抑制能力越强。进一步分析可知，不同化合物对A549细胞的抗增殖作用随浓度变化趋势不同，化合物1a、1b、2a的浓度到达100 μmol/L时，对A549细胞抗增值作用已经接近于80 %且趋于平缓；而只有化合物2b浓度为80 μmol/L/时其抑制率已经超过80 %，故化合物2b具有良好的抑制肿瘤细胞的作用。

香豆素化合物的抗肿瘤活性可通过增值抑制率的IC50值体现，抗肿瘤活性越高，IC50值越小。通过对比发现：4种香豆素化合物（1a、1b、2a、2b）的抗肿瘤活性分别为：38.48、33.53、31.66、21.76 μmol/L；而VC的抗肿瘤活性>100 μmol/L，这与已报到的文献相一致[13-14]。抗肿瘤活性的强弱依次为：化合物2b> 2a> 1b> 1a>VC；同时，吸电子基团CF3取代香豆素衍生物抗肿瘤细胞增值活性优于CH3取代香豆素衍生物。

3　结论

运用电子顺磁共振和MTS两种方法分别对香豆素化合物的自由基清除能力及抗肿瘤活性进行测定。试验结果表明，双羟基香豆素类化合物不仅对DPPH自由基具有较好的清除能力，而且对肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制活性，且均与香豆素的浓度呈正相关性。此试验中的香豆素化合物清除DPPH自由基能力及抗肿瘤细胞增殖活性均优于VC，其中自由基清除能力最强为化合物1a（EC50=9.04 μmol/L），抗肿瘤活性最好的是化合物2b（IC50=21.76 μmol/L），该研究为具有癌症防治功能的天然产物抗氧化剂的开发利用提供试验依据。

总之，从天然植物中寻找天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品行业的发展趋势，具有治疗作用的天然抗氧化剂也将是现代医药、保健行业的发展方向。因此，基于天然植物，筛选和开发抗氧化作用确切、安全无毒的新品种或分离提取其有效抗氧化成分，并针对其抗氧化机理、协同作用、构效关系和分子设计等方面开展深入研究，将为天然抗氧化剂的应用开发奠定理论基础和指导思路。

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Studies on Radical Scavenging and Anti-tumor Effects of Coumarins

ZHANG Na，CEHN Wen-juan，LIU Qing-qing，ZHOU Yue，ZHONG Ru-gang
（College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China）

Abstract：The free radical DPPH scavenging and anti-tumor activity of four dihydroxy coumarin derivatives and VCwere investigated using electron paramagnetic resonance（EPR）and MTS methods. The results showed that the ranges of EC50（radical scavenging ability）and IC50（antitumor activity）values of four compounds were 9.04 μmol/L-37.32 μmol/L and 21.76 μmol/L-38.48 μmol/L，respectively，and therefore the radical scavenging and anti-tumor ability of four compounds were more potential than those of VCwith EC50=42.44 μmol/L and IC50>100 μmol/L，respectively. Compound 1a（EC50=9.04 μmol/L）and 2b（IC50=21.76 μmol/L）were the most active compounds at DDPH radical scavenging and antitumor，respectively. In conclusion，compared with VC，four coumarin compounds exhibited more potential ability at radical scavenging and antitumor cell proliferation，and were considered as the natural antioxidant with free radical scavenging abilityand antitumor activity.

Key words：coumarins；radical scavenging ability；antitumor activity；EPR；MTS

收稿日期：2015-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.001

作者简介：张娜（1981—），女（汉），助理研究员，博士，研究方向：天然抗氧化剂研究与开发。

基金项目：国家自然科学基金（81402852）；北京市自然科学基金（7152013）；北京市教育委员会科技计划（KM201610005031）