血府逐瘀汤促血管新生中EphB4/ephrinB2信号通路的作用研究*

许晓玲，蔡 飞，林 凡，王一铮，高 冬△，宋 军

(1.福建中医药大学中西医结合学院，福州 350108;2.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

血府逐瘀汤促血管新生中EphB4/ephrinB2信号通路的作用研究*

许晓玲1，蔡 飞1，林 凡1，王一铮1，高 冬1△，宋 军2

(1.福建中医药大学中西医结合学院，福州 350108;2.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

目的:探讨EphB4/ephrinB2信号通路在血府逐瘀汤促血管新生中的作用。方法:运用血清药理学方法，以1.25%、2.5%、5%浓度的血府逐瘀汤含药血清和空白血清干预人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC-12)48 h，通过MTT法、Boyden小室迁移法、细胞黏附法、逆转录PCR法分别检测细胞增殖、迁移、黏附、EphB4和EphrinB2基因表达的情况。结果:与同血清含量的对照组比较，5%浓度含药血清对细胞的增殖能力起抑制作用。1.25%、2.5%和5%3个浓度含药血清皆有显著的促内皮细胞迁移和黏附作用，并能抑制EphB4的表达，其中1.25%、2.5%浓度含药血清抑制EphrinB2的表达。结论:血府逐瘀汤通过促内皮细胞迁移和黏附发挥促血管新生作用，且该作用可能与EphB4/EphrinB2通路密切相关。

血府逐瘀汤;EphB4/ephrinB2;血管新生

血府逐瘀汤为清·王清任所创立的活血化瘀经典方剂之一。该方配伍严谨，活血药与理气药并用，临床防治心脑血管性疾病疗效显著。前期研究证实，血府逐瘀汤具有较好的促血管新生作用，但具体作用机制复杂，呈多途径、多靶点特征［1-4］。EphB4/ ephrinB2在调节血管生成方面受到越来越多的关注，其独特的双向信号在血管新生活动包括内皮细胞的增殖、迁移、黏附、分化等过程中起着重要的调控作用［4-5］。探索血府逐瘀汤如何通过 EphB4/ ephrinB2信号通路发挥促血管新生调控作用，有助于为临床应用提供实验支持。

1 实验方法

1.1 药物制备

血府逐瘀汤组成:当归9 g，生地9 g，桃仁12 g，红花9 g，枳壳6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g。水煎服，每日2次。煎液过滤、混合后加热浓缩至含生药量1.3 g/mL，4℃保存备用，药物购自福建中医药大学国医堂第二门诊部。

1.2 动物分组及血清制备

SD6周龄大鼠，体质量(150±30)g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。经福建中医药大学动物房常规饲养，3 d适应性喂养后按随机数字表法分为药物组(血府逐瘀汤组)和对照组(生理盐水组)各20只。药物组按13 g/k g(相当于人临床用量的10倍)剂量即10 mL/kg灌胃，对照组用等剂量生理盐水，每天2次，连续灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，采用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，4000 r/min，离心30 min分离血清，56℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌后置－20℃保存备用。

1.3 试剂及设备

DMEM高糖培养液和胎牛血清(美国 Hyclone公司)，MTT粉剂(美国 Biosharp公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，Oligo D(t)18(大连宝生物)，Taq DNA聚合酶(美国Fermentas公司)，PCR Buffer(美国Fermentas公司)，Goldview核酸染液(上海赛百盛生物有限公司)，琼脂糖(美国 Sigma公司)，Boyden小室(江苏省海门市麒麟医用仪器厂)，IX70倒置相差显微镜及数码摄像装置(日本尼康公司)，ELX800全自动酶标仪 (美国 BioTek公司)，Barnstead纯水系统(美国 Thermo公司)，Eppendorf高速台式离心机和基因扩增仪(德国 Eppendorf公司)，DYY-6C型电泳仪 和DYCP-3K型电泳槽(北京市六一仪器厂)，SHP250型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，全自动凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4 内皮细胞培养及药物诱导处理

内皮细胞HUVEC-12购于中南大学湘雅中心实验室，采用5%胎牛血清 DMEM培养液，以2.5× 105/mL密度进行接种，25 cm2培养瓶接种量为每瓶1mL，于37℃、5%CO2常规培养，待5 h细胞贴壁后弃去培养液随机分成药物组和对照组，药物组换1.25%、2.5%、5%含药血清的DMEM培养液，对照组分别换含等量对照血清的 DMEM培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h备用。

1.5 MTT实验

培养在96孔板内的HUVEC-12共计6组经药物和生理盐水分别干预48 h后，每孔加入20 μL，5 mg/mL的MTT，孵育4 h后弃去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，振荡15 min后于酶标仪检测530 nm波长的OD值，参比波长630 nm。

1.6 迁移实验

收集各组细胞培养液上清液于Boyden小室的下室，室间置以8 μm的聚碳酸酯膜，上室加入对应组别的细胞2×104，于37℃、5%CO2培养箱中培养8 h，聚碳酸酯膜经棉签轻轻刮去上室面的细胞，中性甲醛固定下室面的细胞，苏木素常规染色，高倍视野(200×)随机计数下室面12个视野下的细胞个数。

1.7 黏附实验

收集各组细胞制成单细胞悬液，以9×103/孔细胞数种入96孔板，于37℃、5%CO2培养箱培养60 min，PBS洗去未贴壁的细胞，每孔加入200 μL中性甲醛固定20 min，100 μL/孔苏木素常规染色15 min，蒸馏水洗去染液后于200倍镜下进行观察(每孔在固定位置取10个视野)。

1.8 RT-PCR(两步法)Trizol法提取

表1显示，HUVEC-12细胞内总RNA并逆转录成cDNA后进行PCR扩增。EphB4、EphrinB2和βactin基因序列从 PUBMED的 Gene Bank数据库中获得，由大连宝生物公司设计并合成。反应体系为10 × Taq buffer5 μL，25mmolMgCl26 μL，10mmmoldNTP 1 μL，模板1.2 μL，1U/μL TaqDNA聚合酶2 μL，10 μmol/L的上下游引物各2 μL，无核酸酶超纯水补齐到50 μL。93℃预变性3 min，变性、退火、延伸各1 min，35个循环，72℃补齐2 min。应用凝胶成像分析系统检测目的基因表达。

表1 引物序列

1.9 统计学方法

采用 SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量数据用均数 ±标准差(±s)表示，组间比较采用 t检验，若不符合正态分布则用Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组细胞增殖能力检测比较

表2显示，与同血清含量的对照组比较，5%浓度含药血清对细胞的增殖起到抑制作用，1.25%和2.5%浓度的组间比较差异无统计学意义，说明较低浓度的药物对细胞增殖不起作用。

2.2 2组细胞迁移能力比较

表2显示，与同血清含量的对照组比较，1.25%、2.5%、5%浓度的含药血清皆能显著提高内皮细胞的迁移能力(P＜0.01)。

2.3 2组细胞黏附能力比较

表 2显示，与同血清含量的对照组比较，1.25%、2.5%、5%浓度的含药血清皆能显著提高内皮细胞的黏附能力(P＜0.01)。

表2 不同浓度含药血清对HUVEC-12细胞的增殖、迁移、黏附能力影响(±s)

表2 不同浓度含药血清对HUVEC-12细胞的增殖、迁移、黏附能力影响(±s)

注:与同血清含量对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 例数 血清含量 增殖 迁移 黏附含药血清空白血清39.0±1.1＊＊51.9±2.5＊＊40.6±5.2＊＊11.9±1.0 21.5±2.0 27.0±1.9 10 10 10 10 10 10 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.086±0.016 0.111±0.027 0.085±0.024*0.099±0.028 0.100±0.012 0.092±0.010 24.0±5.5＊＊34.3±1.3＊＊36.0±0.8＊＊14.2±0.4 7.6±1.1 13.0±1.2

2.4 RT-PCR检测结果

表3显示，药物血清可以抑制 EphrinB2和EphB42个基因的表达，但具体情况稍有不同。与同血清含量的对照组比较，只有1.25%，2.5%2个较低浓度含药血清抑制 EphrinB2的表达，而对于EphB4，3个浓度含药血清皆抑制其表达。

3 讨论

血管新生是指在原有毛细血管网基础上，通过内皮细胞增殖、迁移、黏附和分化形成新的毛细血管网的过程。本实验结果提示，血府逐瘀汤1.25%、2.5%、5%3个浓度含药血清对HUVEC-12的迁移、黏附都有显著的促进作用，与课题组前期其他细胞株的研究结果一致［1］，说明药物从细胞水平通过影响内皮细胞迁移和黏附发挥促血管生长作用。有学者［6］认为，血府逐瘀汤含药血清可抑制牛内皮细胞迁移，并与浓度呈正相关，其所用的含药血清浓度为10%以上。本实验中高浓度5%含药血清抑制了细胞的增殖，与上述学者更高浓度的药物血清作用一致，提示药物促血管生长的局限性。本课题组前期在体实验［4，7］显示，血府逐瘀汤在缺血损伤早期有效促进肉芽组织血管新生的作用随肉芽组织的纤维化而消失，出现短暂促血管生长的特点。检测不同浓度药物血清对内皮细胞ECV304增殖、迁移和体外成血管的影响提示存在浓度限定范围［8］。在体和离体实验结果一致体现血府逐瘀汤促血管新生作用限制于某个较适宜的浓度和作用时间点［1，5］，体现了药物对血管生长的独特调控性。

表3 药物对HUVEC-12细胞目的基因表达的影响结果(±s)

表3 药物对HUVEC-12细胞目的基因表达的影响结果(±s)

注:与同血清含量对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 例数 血清含量 EphB4灰度值 ephrinB2灰度值含药血清空白血清0.44±0.12*0.27±0.08＊＊0.34±0.11 0.70±0.15 0.64±0.04 0.49±0.09 4 4 4 4 4 4 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.25±0.04＊＊0.70±0.02*0.15±0.04＊＊0.85±0.02 0.77±0.05 0.33±0.04

EphB4与 EphrinB2是酪氨酸蛋白激酶受体家族成员，二者互为配、受体。前期大量实验集中于EphB4/EphrinB2在胚胎发育期与动静脉分化的关系，随后发现其影响细胞迁移等功能，在调控血管新生过程中发挥着重要作用。如有研究［9］表明，显微注射信号EphrinB2可以不依赖于受体EphB4的结合直接增加 HUVECs细胞的迁移速度，提示该信号本身就可独立发挥作用，但更多实验关注通路对血管新生的影响。该通路并不局限于信号 EphrinB2与受体EphB4的正向传导，还可通过细胞间的接触形成EphB4作为信号。EphrinB2作为受体的独特反向信号传递，由于双向信号的复杂性和实验设计的差异性，除少数研究得出相反的结论［10-11］外，目前多数研究认为正向信号抑制内皮细胞的增殖、迁移、黏附和血管新生，反向信号促进上述过程进而促血管新生［12-13］。本实验中药物对 HUVEC-12的迁移、黏附都有显著的促进作用，同时 EphB4和EphrinB2基因皆下调表达，说明药物促血管新生的作用机制确实与 EphB4/EphrinB2通路密切相关。究竟药物调控血管生长主要通过影响正向还是反向抑或双向信号均发生反应，尚需进一步的开展EphB4和EphrinB2蛋白磷酸化改变的研究才能得到明确结论。

EphB4/EphrinB2影响血管生长的研究已持续10余年，鉴于其重要作用，有学者推测 EphB4/ EphrinB2通路有望成为又一抗血管生成的靶向目标。采用特定的 EphrinB2抗体代替或与现有的抗血管生成药联用，有可能为血管相关性疾病提供有效的治疗策略［12］。由于其双向通路的复杂性为明确机制设置了障碍，通过本项目研究有助于进一步认识EphB4/EphrinB2信号通路对血管新生的调控作用，并为血府逐瘀汤的临床应用提供更坚实的实验依据。

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Roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction

XU Xiao-ling1，CAI Fei1，LIN Fang1，WANG Yi-zheng1，GAO Dong1△，SONG Jun2
(1.Department of integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China; 2.Experimental Reserch Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China.)

object To explore the roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction (XZD).Methods:Using serum pharmacology technique to study the cell proliferation，migration，adhesion，ephrinB2 and EphB4 gene expression by MTT，Boyden chamber，cell adhesion and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR)separately on Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC-12)after intervened by 1.25%，2.5%and 5% XZD containing serums for 48h.ResultsComparison with the control group of same serum level，5%medicated serum inhibited cell proliferation.1.25%，2.5% and 5% medicated serum had significant effect on promoting endothelial cell migration or adhesion and inhibition the EphB4 expression.1.25% and 2.5% medicated serum inhibited EphrinB2 expression.ConclusionXZD had significant effect on cell migration and adhesion to promote angiogenesis which is closely related to the EphB4/EphrinB2.

Xuefu Zhuyu Decoction;EphB4/ephrinB2;angiogenesis

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0362-03

2015-08-22

国家自然科学基金资助项目(O.81173431)

许晓玲(1987-)，女，漳州人，医学硕士，从事活血化瘀药物应用的基础研究。

△通讯作者:高 冬，Tel:0591-22861151，E-mail:gd1026@ yahoo.com.cn。