慢性应激对小鼠空间学习记忆的影响及脑内Wnt3a的表达

李洋　肖婧姗　张忠秋　李亚

【摘 要】目的：研究慢性应激对小鼠空间学习记忆的影响及机制。方法：慢性应激模型的建立采用的是持续21天的7种不同应激方式，通过Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力，免疫组织化学方法检验小鼠脑内各脑区wnt3a的表达。结果：慢性应激组小鼠与对照组小鼠相比，在定位航行试验中，小鼠寻找平台的逃避潜伏期明显提高（P<0.05），空间搜索实验中，应激组小鼠在目标象限的游泳时间明显减少（P<0.05）。在小鼠脑内PFC区wnt3a表达显著减少（P<0.01）。结论：慢性应激对小鼠空间学习记忆的能力具有损伤作用，这与wnt3a在脑内的表达关系密切。

【关键词】慢性应激；学习记忆；Wnt3a；海马；前脑皮层

【Abstract】Objective To study the effects of chronic stress on the spatial learning-memory function of mice and its mechanism. Method The chronic stress model of mice was induced by stimulation of multiple stressors for 21 days. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water maze task， and the expression of Wnt3a in the hippocampus and prefrontal cortex were detected by immunohistochemical method .Result After chronic stress， the stress groups escape latency in the place navigation test were significantly higher than control group mice（P<0.05）. In the spatial search test， after chronic stress ，respectively compared with control group mice， in first quadrant （i.e. platform quadrant） the swimming time of stress group mice were obviously shortened（P<0.05）. TheWnt3a expression in PFC were significantly shortened in stress group mice（P<0.01）. Conclusion The ability of chronic stress on spatial learning and memory in mice has the function of damage， which is closely related to the expression of Wnt3a in brain.

【Key words】Chronic stress； Learning and memory； Wnt3a； Hippocampus； Prefrontal cortex

研究表明，长期强烈身心应激严重影响着人类的身心健康，使机体出现抑郁症、学习记忆障碍、应激性精神紊乱、免疫力低下等多系统疾病[1]。慢性应激可以诱导抑郁症已成为公认事实，有抑郁症史的自杀病人的行为表现与慢性应激引发症状非常一致[2， 3]。慢性应激可造成机体大脑器质性损坏，尤其是海马结构和功能的损害，最终引发抑郁症[4]。相关研究发现，在正常成年哺乳动物中枢神经系统（central nervous system，CNS）中Wnt3a可以促进神经发生来进行自我更新与组织修复，在蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤研究中，Wnt3a可能通过经典Wnt 信号通路促进神经发生，对中枢神经系统的修复与保护发挥积极作用[5]。本实验研究慢性应激模型小鼠空间学习记忆功能的变化以及海马和前额叶皮层Wnt3a 表达的变化，探讨慢性应激对小鼠空间学习记忆的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与建立慢性应激动物模型

2月龄的昆明品系小白鼠，体重20±2g，雌雄各半，购于山东济宁鲁抗医药公司动物实验中心。小鼠适应一周。饮水，进食自由，随机分为对照组和应激组，每组12 只。

应激组采用多因素的慢性不可预知应激动物模型进行研究。其中应激组为：小鼠在21天内接受7应激源刺激包括高台（1 h，高台呈圆柱体高1.6m，直径0.05m）、通宵照明（10h）、冰水游泳（8℃冷水中游泳3min）、禁食（36h）、禁水（24h）、斜笼拥挤（36h）、足底电击（电压36V，1min/次，每次持续10s，共30次）。每天给予一种刺激（采用无规则的交替刺激）使小鼠无法预知应激源的变化以及刺激的发生；对照组小鼠在相同饲养环境中正常饲养21天，不接受任何实验应激源。对照组不接受应激，正常状态饲养。

1.2 Morris水迷宫检测学习记忆能力

采用Morris 水迷宫，检测两组小鼠的学习记忆能力。Morris 水迷宫由圆形水池和池内一可移动平台组成，直径80cm，高50cm，水温26±1℃。测试程序包括定位航行和空间搜索两个实验步骤。水迷宫被均分为4个象限，平台置放于第一象限（目标象限），并在第三象限池壁做红色标记，使之于平台连线为水池直径。定位航行实验共2d，每只小鼠每天两个训练周期，每个周期内接受4 次找平台训练，小鼠分别对应一个象限入水，每次训练120s。记录小鼠入水至找到水下平台的逃避潜伏期（escape latency）。第3d 进行空间搜索试验，撤除平台，小鼠由第三象限入水点入水， 记录小鼠120s 内在4 个象限的游泳时间，以检测小鼠对平台（目标象限）的记忆能力。

1.3 小鼠海马和前脑皮层Wnt3a的表达

在完成水迷宫空间试验后，戊巴比妥钠注射麻醉小鼠，取出心脏，快速灌注37℃生理盐水50ml 及4℃的4%多聚甲醛溶液50ml，开颅取脑，后固定2h，酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后进行冠状切片（厚约5μm）。免疫组化实验一抗及试剂盒均购自武汉博士德生物公司，按照试剂盒的要求操作。阴性对照选择PBS（磷酸缓冲液）代替一抗。选择每只小鼠相应海马部位和前脑皮层（PFC）切片3 张，每张随机选取两个不相重叠的视野，用Motic Images Advanced 3.2 图像处理系统对海马和前脑皮层的Wnt3a阳性细胞平均目标灰度值进行分析。

1.4 统计学处理

所有数据以平均数±标准差（M±s）来表示，逃避潜伏期采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳时间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较以Newman-Keuls 法分析。其他数据组间比较用非配对t 检验分析。P<0.05 时说明有统计学差异。

2 结果

2.1 各组小鼠空间学习记忆功能的变化

定位航行试验数据进行统计学分析结果显示（表1）：慢性应激后，对照组和应激组两组小鼠随训练其逃避潜伏期均显著降低（F= 4.958，P<0.01；F= 7.225，P<0.01）。在4个训练周期中，应激组小鼠的逃避潜伏期均长于对照组小鼠（P<0.05）。结果表明，慢性应激对小鼠的空间学习记忆功能造成损伤。

空间搜索实验中各组小鼠实验统计结果如下（表2）：慢性应激后，各组小鼠的游泳停留时间均在第一象限（即平台象限）最长。对照组小鼠在慢性应激后，与其余三个象限比较，在第一象限的游泳时间显著延长（F= 5.452，P<0.01）；与其它三个象限比较，而应激组小鼠在慢性应激后在第一象限的停留时间差异不显著（F= 0.6124，P>0.05）。在第一象限的组间比较：慢性应激后，相较于对照组，应激组的游泳时间明显延长（P<0.05）。

2.2 各组小鼠海马和前脑皮层wnt3a表达

小鼠免疫组化结果（表3）：在对照组小鼠海马CA1、CA3椎体细胞层和DG区颗粒细胞神经元中均未明显表达Wnt3a且差异不明显；但在前脑皮层中，与对照组比较，应激组小鼠在应激即刻Wnt3a阳性细胞数显著减少（P<0.01）。

3 讨论

慢性应激可导致机体大脑器质性损坏，尤其是海马结构和功能的损害，最终引发抑郁症，而且有神经精神系统损伤[6]。慢性应激导致脑损伤的同时有一个与之相反的活动保护着中枢神经系统，也就是神经发生。有研究报道，在正常成年哺乳动物CNS中Wnt3a 可以促进神经发生来进行自我更新与组织修复；在早期脑损伤研究中，Wnt3a 可能通过经典Wnt 信号通路促进神经发生[5]，对中枢神经系统的修复与保护发挥积极作用。Wnt3a 之所以能够增强神经发生作用，其机制可能与Wnt 通路有关[7]。已有研究显示，Wnt 信号通路参与了成年期NSCs 的增殖、分化以及细胞命运的调控[8]，甚至对神经系统的发育包括突触形成、建立皮质模式等也是至关重要的[9]。本研究中，慢性应激后，各组小鼠的游泳停留时间均在第一象限（即平台象限）最长，提示小鼠均获得记忆。在第一象限的组间比较：慢性应激后相较于对照组，应激组的游泳时间明显延长；提示慢性应激使学习记忆遭受一定程度的损坏。小鼠在慢性应激后各脑区wnt3a表达结果表明，小鼠的海马各区均未有明显的wnt3a表达，与部分文献报道类似，推测这可能与检测时间有一定的关系。在对照组小鼠的PFC，wnt3a广泛表达，而应激组小鼠PFC区的wnt3a阳性细胞数量显著减少，阳性表达较弱，细胞着色浅。本实验研究说明，慢性应激对小鼠空间学习记忆的能力具有损伤作用，并且对应激后的恢复产生影响，这与wnt3a在脑内的表达关系密切；wnt3a对慢性应激导致的学习记忆能力的损伤有一定的保护作用。

【参考文献】

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[2]Osvath P， Voros V， Fekete S. Life Events and Psychopathology in a Group of Suicide Attempters[J]. Psychopathology， 2004， 37（1）：36-40.

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[责任编辑：张涛]