基于细胞凋亡探讨针刺作用机理的研究述评

陈琳,吴巧凤,杨明晓,邓淑芳,柏琳,陈亮,梁繁荣



基于细胞凋亡探讨针刺作用机理的研究述评

陈琳,吴巧凤,杨明晓,邓淑芳,柏琳,陈亮,梁繁荣

(成都中医药大学针灸推拿学院,成都 610075)

细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主有序的死亡过程,它们在促进生物体的进化、调控多个系统的发育以及维持内环境的稳定中起着重要的作用。其中线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路是细胞凋亡的主要通路。随着针刺基础科研的迅猛发展,各项成果显示针刺发挥疗效的重要机制之一与细胞凋亡密切相关。目前发现与针刺凋亡作用相关的凋亡分子研究主要集中在P53、Bcl-2家族、Cyt-C、Caspase、死亡受体Fas/Fasl和TNFR1/TNF-a、FADD-Caspase8、PERK等,通过对这些凋亡分子或基因产生影响,针刺发挥了改善组织缺血状态、保护神经细胞、减轻炎症、改善内分泌紊乱等众多作用。该文对与针刺作用密切相关的细胞凋亡途径及重要分子进行了总结与述评,为今后的相关研究提供一些有益参考。

针刺;细胞凋亡;作用机理;综述文献

细胞凋亡(apoptpsis)是多细胞有机体为促进生物体的进化、调控机体发育和维护内环境的稳定而由基因控制的细胞主动死亡过程[1]。细胞凋亡过程的发生、发展都受到精确的调控,具有独特的信号通路。目前研究表明,细胞凋亡通路主要有3条,即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。线粒体通路又称为内源性凋亡途径,由于线粒体被认为处于哺乳动物细胞凋亡调控的中心位置,因此对该通路的研究一直占有重要地位。线粒体凋亡通路的主要过程是,当细胞受损后,细胞色素C(Cyt-C)从线粒体释放,与细胞凋亡激活因子1(Apaf-1)结合活化Caspase-9前体,从而激活Caspase-3,引发Caspase级联反应,最终导致细胞凋亡的发生[2]。死亡受体通路又称为外源性凋亡途径,该途径的信号转导通路主要包括Fas、TNFR1、DR4/DR5和DR3,虽然这4条通路的启动、传导与调控各不相同,但也并非完全独立,交汇点表现在其都是通过各自渠道激活Caspase后引发细胞凋亡[3]。内质网应激通路是不同于线粒体和死亡受体通路,且能独立诱导细胞凋亡的一条新通路。当内质网应激激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)时,UPR可促进细胞生存和凋亡的双向调节,该作用与UPR对Ca2﹢的浓度、mRNA表达以及JNK通路等的调节有密切关系[4]。凋亡刺激信号可以激活线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路中的一种,3条通路间也存在相互影响,从而协同诱导细胞凋亡。

虽然细胞凋亡是一个全新的现代生命科学概念,但传统中医理论中不乏有与之类似的论述。例如,《内经》中关于“阴阳生杀之本始”的记载描述了机体的生发(细胞增殖)与衰减(细胞凋亡)的根本态势始终处于阴阳动态平衡中[5]。这与细胞凋亡理论的内涵就有契合之处,细胞在增殖与凋亡过程中,机体可同时消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的动态平衡,此功能一旦失常,则易于导致疾病的产生[6]。目前的研究显示,肿瘤、自身免疫系统疾病、心血管疾病、神经元退行性疾病、病毒感染等疾病都与细胞的凋亡密切相关[7-9]。针刺疗法作为中医学的独特分支,秉承了中医理论的精髓,能发挥“调和阴阳”作用使机体恢复“阴平阳秘”的健康状态。现有的科研成果表明针刺疗法可参与细胞凋亡的调控,其机制则主要是通过调节诱导基因、细胞因子和细胞内小分子等方法实现的[10]。通过大量的文献复习,我们发现针刺作用与线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路均有关系,现总结如下。

1 针刺与线粒体凋亡通路

1.1 P53

P53蛋白在细胞凋亡过程中起着相当重要的作用,它参与细胞应激信息与相关基因之间的传导,诱导细胞的凋亡。刘丹等[11]用电针刺激慢性脑缺血大鼠督脉腧穴神庭、百会、风府和大椎,运用免疫组化法发现针刺后患鼠脑组织中P53表达降低,且立即针刺组效果明显优于他组。此结果表明电针督脉能积极改善P53的表达,促进细胞的存活。Liu JF等[12]运用针刺疗法对阿尔茨海默病模型大鼠进行干预,前后对比发现,针刺可显著下调P53,有效地抑制细胞凋亡,改善患鼠的记忆和认知功能。

1.2 Bcl-2家族

Bcl-2家族是线粒体凋亡途径中关键的凋亡调控因子,根据其生物学效应的不同,一般可将其归为3类,即Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等抗细胞凋亡类蛋白;Bax、Bak等促细胞凋亡类蛋白以及Bad、Bid、Bim等促凋亡蛋白中的特殊成员[13]。刘勇等[14]对缺血性中风大鼠模型在不同时间点施以针刺双侧风池,患侧百会透曲鬓、内关以及足三里,发现针刺后患鼠的Bcl-2蛋白表达均提高,Bax蛋白表达均降低。从而实现了通过升高Bcl-2水平抑制Bax表达来控制缺血性中风大鼠神经细胞的凋亡,降低该病的致残率。孙河等[15]对针刺球后、风池和行间干预青光眼兔模型的机理进行研究,发现针刺参与视神经的保护机制与视网膜Bcl-xl和BDNF的表达有关,针刺可有效上调Bcl-xl,抑制促凋亡蛋白,发挥神经元保护作用。

1.3 细胞色素C(Cyt-C)

Cyt-C作为首个被证实在凋亡细胞线粒体中释放的蛋白,其参与诱导多种细胞的凋亡且具有不可逆性[16]。陈荣良等[17]使用加长的毫针针刺脊髓损伤家兔模型的秩边、水道、气海和中极穴,观察到患兔在针刺治疗后其脊髓损伤和细胞凋亡情况明显好转,推测该效应与针刺上调p-Akt、p-ERK1/2,下调Cyt-C和Caspase-3的表达密切相关。庞晓英[18]对2型糖尿病的胰岛b细胞凋亡情况展开研究,运用皮内针浅刺内庭、足三里、胰俞3穴可使胞浆中Cyt-C量减少,抑制胰岛b细胞凋亡,维持胰岛素分泌功能正常。

1.4 Caspase-9和Caspase-3

Caspase即含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,其参与细胞的生长、分化与凋亡调节。Caspase家族可引发一系列的级联反应,该反应过程为细胞凋亡的中心环节,可激活细胞凋亡的线粒体通路和死亡信号通路,处于下游的Caspase一旦被激活,将导致细胞凋亡的发生。Caspase-9处于细胞凋亡信号转导通路的上游,其可在线粒体释放Cyt-C后被激活,从而活化细胞凋亡中最关键的酶Caspase-3。范春玲等[19]关注脑出血大鼠脑组织Caspase-3的表达情况,经头针透刺干预,脑部血肿周围的Caspase-3活化得到有效的抑制,从而使Caspase-3参与诱导的细胞凋亡减轻,神经细胞得到保护。郑婉群等[20]观察针灸通督法、常规针刺法和药物法对缺血性脑卒中患者细胞凋亡相关指标Caspase-9和Caspase-3水平的影响,发现针灸通督法也能显著抑制Caspase-9和Caspase-3的表达,阻断凋亡信号的传导,发挥神经元保护作用。

2 针刺与死亡受体凋亡通路

2.1 Fas/Fasl

死亡受体通路作为细胞凋亡的外在途径,胞外的死亡信号与细胞表面的死亡受体相结合激活细胞凋亡机制,引发细胞凋亡[21]。Fas是最典型的死亡受体,可由其配体Fasl激活,引发下游Caspase相关反应。哮喘呼吸道炎性反应以嗜酸细胞浸润为典型的病理特征,吴兆利等[22]以此为突破口选取针刺足三里对哮喘大鼠模型进行治疗,原位杂交法检测模型大鼠肺组织中的Fas mRNA和Bcl-2 mRNA的表达,研究发现针刺足三里能有效上调Fas mRNA和下调Bcl-2 mRNA,扭转其失衡状态,从而促进嗜酸细胞凋亡,抑制炎症反应。张月梅等[23]对去势雄兔干眼模型施以针刺治疗,应用免疫组化法检测泪腺上皮细胞相关蛋白Fas/Fasl的表达情况,结果显示在针刺治疗7星期后Fas/Fasl的表达下降,且与正常组相比差异无统计学意义(＞0.05),该实验说明针刺能通过下调Fas/Fasl达到对泪腺上皮细胞凋亡的抑制作用。

2.2 TNFR1/TNF-a

TNFR1与TNF-a相结合可诱导细胞凋亡,特殊的是TNFR只有在蛋白合成被阻断的情况下才可诱导凋亡。TNFR也是典型的死亡受体之一。Wang ZK等[24]对针刺干预的时间与缺血再灌注损伤之间的关系进行研究,发现患鼠的IL-1和TNFR1 mRNA表达明显升高,针刺能有效地扭转其过分表达,阻断细胞凋亡信号的传导并参与大脑的保护。随着对克罗恩病发病机制的进一步探讨,人们已经认识到在克罗恩病的免疫应答中TNF-a起着关键性作用[25]。施茵等[26]对克罗恩病患者隔药灸配合针刺治疗前后肠黏膜TNF-a、TNFR1、TNFR2的表达和细胞凋亡情况进行对比,发现该方法对患者异常增高的TNF-a、TNFR1、TNFR2能起到良性调节作用,从而推断针灸的作用与抑制肠上皮细胞异常凋亡,减轻肠炎症反应有关。

2.3 FADD-Caspase8

在Fas-FADD-Caspase8介导的细胞凋亡过程中,FADD与Fas之间的相互作用扮演着重要角色。而无论是在线粒体介导的内源性凋亡通路还是死亡受体介导的外源性通路,Caspase8蛋白都是关键的调控蛋白[27]。罗文舒等[28]对脑缺血再灌注损伤大鼠督脉穴位百会、大椎、气海、关元进行针刺,Western blot法检测发现,针刺治疗在24 h和72 h即可下调FADD和Caspase8蛋白的表达,阻断Caspase级联反应和多种死亡底物的产生,减少脑细胞的凋亡,改善脑缺血再灌注损伤。Cheng CY等[29]在对亚急性期的缺血再灌注损伤大鼠的针刺治疗研究中也得出了类似的结论,针刺可使患鼠FADD、Caspase8以及TNF-a/TRADD等表达下降,促使细胞凋亡通路被阻断,发挥大脑保护作用。

3 针刺与内质网凋亡通路

据研究证实,持续或者强烈的内质网应激反应可诱导细胞凋亡[30-31],其中的未折叠蛋白反应是目前研究最充分的一类。未折叠蛋白反应的主要通路有3条,包括PERK信号通路、IRE信号通路和ATF-6信号通路。现有的针刺文献显示,针刺能有效地参与抑制内质网应激反应,从而发挥机体细胞的保护作用。郜婕等[32]进行了关于电针对内质网的影响的研究,观察电针治疗前后肥胖大鼠附睾脂肪组织中的p-PERK和CHOP/ GADD153表达情况,二者在电针干预后都得到了不同程度的下调,虽然此时内质网应激依然存在,但由于其程度较弱,细胞仍可维持正常的功能状态。郁洁等[33]的研究发现大鼠脑缺血再灌注损伤的发生、发展与转归都与PERK与elF2a参与抑制细胞蛋白质的合成密切相关,针刺可以靶向性地抑制elF2a的表达,这可能是针刺抑制细胞凋亡,参与脑保护的内在机制之一。

4 针刺干预细胞凋亡的现状及展望

细胞凋亡是生物体内一个非常复杂的过程,其3条信号通路呈现出复杂的网状调控结构,既相互独立又相互联系,细胞凋亡是这些通路平衡协调的共同结果。关于药物诱导或者抑制细胞凋亡的研究已较为成熟,但其多为多肽大分子,难以通过血脑屏障并且毒副反应大,特异性差。与外源性药物干预的机制不同,针刺主要是通过激发内源性系统发挥作用,同时针刺还具备双向调节作用,因此,对针刺与细胞凋亡的相关性进行研究意义非凡。目前来看,针刺干预细胞凋亡的基础研究尚处于起步阶段,但该领域的研究已经逐渐受到重视,从最初仅局限于心脑血管疾病相关组织细胞凋亡情况研究,现已扩展到针刺作用于呼吸系统、消化系统、神经系统等多个疾病领域。

现有研究表明,针刺参与改善组织缺血、神经细胞保护、炎症抑制、调节内分泌的机制与针刺对P53、Bcl-2家族、Cyt-C、Caspase、死亡受体Fas/Fasl和TNFR1/TNF-a、FADD-Caspase8、PERK的靶点调控作用密切相关。

但随着研究的深入,我们也从中发现了一些问题。①在凋亡过程中,细胞的形态、细胞膜的通透性以及跨膜电位等都呈现出一个动态的变化过程,因此关于针刺对细胞凋亡的调控和影响的研究也不应该仅仅针对某一节点,而应该是一个动态的观察过程。②现有的研究多集中在个别基因、蛋白和小分子,还不完善。对Bcl-2家族、Caspase、TNFR1/TNF-a等相关基因蛋白的研究存在重复,而关于针刺调控细胞凋亡是否与NF-kB通路、死亡受体DR3、DR5、DR4通路,IRE和ATF-6通路等多条通路有关,现有的文献多未涉及。虽注重了细胞凋亡过程中各作用靶点的精确性,却忽视了各条凋亡通路间的相互影响作用。③在选穴、配穴方面,虽有极少部分学者将针刺穴位与非穴位对Bcl-2和Bax等细胞凋亡蛋白的影响异同纳入研究,但鲜有提及循经、非循经在调控细胞凋亡方面是否存在差异进行探讨,经穴效应的特异性在此处是否同样适用尚存疑惑。而对于单个穴位是否仅参与单个凋亡相关基因调控,配穴是否能发挥联合调控效应等内容也有待证实。④除此之外,需引起我们注意的是目前仍然缺乏对针刺时效以及量效的系统研究,针刺的介入时间、干预时长、针刺的深度、捻转手法以及电针的波形与频率,这些参数都是为临床服务的保证。

因此,今后可通过运用形态学检测法、免疫组化法、蛋白质印记法、线粒体膜电位检测法、基因芯片、PCR-ARRAY等多种现代研究技术与方法对针刺前后的细胞、分子等进行检测,将极大地促进相关研究的发展。此外,应考虑到针刺效应本就是一个多因素作用的共同结果,现已有少数学者不再是单纯地观察针刺是否具有细胞凋亡调控效应,而是将针刺相关因素,例如针刺时间、针刺手法纳入细胞凋亡的研究,此举将进一步推动针灸科研进行成果转化,为临床医生的实践提供更充分的指导。

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Research Review of the Action Mechanism of Acupuncture Based on Cell Apoptosis

CHEN Lin, WU Qiao-feng, YANG Ming-xiao, DENG Shu-fang, BAI Lin, CHEN Liang, LIANG Fan-rong.

School of Acupuncture and Tuina, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China

Apoptosis refers to the programmed death process of cells modulated by genes. It plays an important role in promoting the evolution of organisms, regulating the development of multiple systems, and maintaining the stability of internal environment. The major apoptosis pathways include mitochondrial pathways, death receptor pathways, and endoplasmic reticulum pathways. With the rapid development of the scientific research on acupuncture, it’s revealed that cell apoptosis should be closely related to the action of acupuncture. So far, the major apoptosis factors involved in relevant researches are P53, Bcl-2 family, Cyt-C, Caspase, Fas/Fasl, TNFR1/TNF-a, and FADD-Caspase8, and PERK, etc. Via influencing these apoptosis factors or genes, acupuncture can produce various effects in improving tissue ischemia, protecting neural cells, reducing inflammation, and correcting endocrine disorders. This article summarized and reviewed the apoptosis pathways and key factors related to the action of acupuncture, to provide some beneficial references for future studies.

Acupuncture; Cell apoptosis; Action mechanism; Literature review

1005-0957(2016)10-1143-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.10.1143

2015-12-30

国家重点基础研究发展计划(2012CB518501);教育部霍英东基础研究基金(141041);四川省科技厅项目(2015JQO058)

陈琳(1989 - ),女,2014级硕士生,Emil:151442861@qq.com

梁繁荣(1956 - ),教授,博士生导师,研究方向为经穴效应特异性基础与临床研究,Email:acuresearch@126.com