禽流感病毒研究进展

包小萌　范 磊　（山东省海阳市动物疫病预防与控制中心　265100）高延娜　（山东省海阳市二十里店镇畜牧兽医站）　宋丽霞　（山东省海阳市辛安镇兽医站）

禽流感病毒研究进展

包小萌范 磊（山东省海阳市动物疫病预防与控制中心265100）高延娜（山东省海阳市二十里店镇畜牧兽医站）宋丽霞（山东省海阳市辛安镇兽医站）

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)可引起禽类的呼吸器官或全身性感染。高致病性禽流感病毒可以直接感染禽类，偶尔也能直接或间接感染人类。禽流感的流行会严重影响畜牧业发展和国际进出口贸易。低致病性禽流感病毒可以经基因突变或基因重配转变成高致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒是在人群中引发流感的一个潜在危险因素，并会严重地威胁人类健康。因此对禽流感病毒的检测和监测以及对其药物的研发和疫苗的研制，已成为世界各国政府及卫生防疫部门日益关注和积极着手解决的重大问题之一。本文将扼要介绍禽流感病毒的发展历程、症状特征、发病机制及药物研发和疫苗研制的现状。

1　禽流感的基本情况

（1）禽流感(Avian Influenza, AI)是禽流行性感冒的简称，又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类急性高度致死性传染病，以急性败血性死亡到无症状带毒等多种病征为特点[1]。该病也可传染给人类。1878年，Porroncito首先在意大利报道该病。1955年Schafer首次证明禽流感病原是A型流感病毒[2]。该病先后传入其他欧洲国家、南美、东南亚、美国及前苏联等国家和地区。禽流感的感染谱很广，大多数的家禽、野禽及水禽都可感染[3]。由于AIV抗原性和致病力的易变性及不同血清型毒株间缺乏交叉保护性，100多年来禽流感在世界各地多次流行，近来又在东南亚一些国家和我国部分地区流行，对养禽业造成重大经济损失。随着生物技术的飞速发展，国内外学者在禽流感病原学、流行病学、诊断技术和疫苗研制等方面的研究取得了较大的进展。（2）禽流感通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。目前国内外都没有针对H7N9禽流感病毒的疫苗。

2　传播历程

（1）1900年代早期，禽流感在意大利被首次确认。1960年1000多只普通燕鸥在南非死亡，这是第一次发现禽流感引发的高死亡率案例，属于H5N3型。（2）根据联合国环境规划署迁徙物种公约工作组公布的技术文件指出，H5N1亚型禽流感的源头来自集中饲养的家禽，极端的饲养环境造成病毒的变异，鸟类贸易、滥用疫苗、运输等人类活动也对禽流感病毒的变异有着推动的作用[4]。野外研究显示，绝大多数罹患禽流感的野生鸟类，都是在迁徙、越冬和繁殖过程中与人类饲养的家禽有近距离接触的物种，而那些自始至终远离人类社会的野生鸟类，即便是水鸟，并且保持很高的种群密度，至今仍未有禽流感暴发的报告。（3）源自饲养场的病毒感染野生鸟类，尤其是水鸟，这使得病毒随着鸟类迁徙而发生扩散。2003年末到2004年初在东亚暴发的禽流感被认为验证了候鸟传播病毒的假设：疫症先在韩国南部，候鸟的中途站出现，然后途经香港，最后到达越南。由于香港相对卫生环境较好，以及先前已具有对付疫症的经验，病症并未有在当地造成大规模暴发。但卫生环境相对较差的越南，不单使禽鸟死亡，还对人类造成影响。至2004年1月底已有接近20人死亡。然而鸟类学者则指出，根据西伯利亚－东亚－澳大利亚鸟类迁徙通道的规律，早在每年的11月末到12月初候鸟就已经基本完成从北向南的迁徙，此前在香港进行的无线电定位跟踪研究也显示，在仲冬季节几乎没有鸟类迁飞的活动[5]。另据观测，绝大部分水鸟的越冬地位于北纬20度以北地区，只有白眉鸭和针尾鸭会迁至越南，然而其过境时间却在12月初。鸟类学者普遍认为从时间和空间上，2003年底暴发的禽流感与候鸟迁徙并无重叠，故此大部分鸟类学者并不认同候鸟传播病毒的说法。（4）被指传播禽流感病毒的不仅仅是候鸟，据2005年10月27日第三届非欧亚迁徙性水鸟保护协定缔约国大会公报指出，携带和传播禽流感病毒的途径除了候鸟的迁徙外，还有牲畜的运输、家禽和笼鸟运输、与这行业相关的活动、合法或非法的鸟类贸易以及人类的交通[6]。（5）在家禽中鸭、鹅一旦受到感染，抗病能力比较高之余，病发后的生存机会也很高。然而，鸡只对流感病毒非常敏感，一旦受到感染的话，不单止传播得快，而且染病的鸡很快就会死亡。农民过去一般称这种现象为“发鸡瘟”，并未有特别留意背后的原因或病发的机制，直到出现禽流感经动物向人传播并至死的病例后，人们才开始关注禽流感。目前人们应对禽流感的主要手段，是对染病以及可能染病的家禽集体屠杀后进行消毒深埋等无害化处理，以免病毒积累，并进而影响人类。（6）在2004年和2005年的禽流感疫情中，也有媒体指出禽流感病毒源自野生鸟类并传播至饲养场，进而传给人类。建议加强对候鸟迁徙的监控，少数激进者甚至主张在扑杀家禽之外对迁徙的候鸟进行扑杀，但这种说法并未获得鸟类学者的认可，扑杀候鸟的建议更招致环保团体的反对[7]。

3　症状体征

3.1潜伏期尚未有准确报道。目前估计在7d以内，一般为1～3d。

3.2临床症状H5N1病毒感染者多呈急性起病，早期表现类似普通型流感，主要为发热，体温大多持续在39℃以上，热程1～7d，一般为3～4d，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、肌肉酸痛和全身不适。部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状。多数轻症病例预后良好[8]。重症患者病情发展迅速，可出现肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾衰竭、败血症、休克及Reye综合征等多种并发症，严重者可致死亡。治疗中若体温持续超过39℃，需警惕重症倾向。H7N7感染者症状较轻，大多数患者可出现眼结膜炎，少数患者伴有温和的流感样症状[9]。H9N2感染者仅引起一过性的流感症状，尚无死亡病例报道。

3.3体征重症患者可有肺部实变体征等。

3.4并发症多数轻症病例预后良好，且不留后遗症。某些病例(特别是H5N1感染者)病情发展迅速，出现重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、多脏器功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征等多种并发症，可导致死亡。1997年香港18例病人中有8例为轻度上呼吸道感染，4例出现重症肺炎，给予呼吸支持后最终痊愈。6例病人监护后仍死于各种并发症[10]。

4　发病机制

禽流感病毒(A)Ⅳ具有较强的变异性。AⅣ有8个基因组片断，当2个或2个以上的不同病毒粒子同时感染一个宿主细胞时，在病毒的增殖第12卷第2期过程中，不同病毒粒子的8个基因组片断可以随机互相交换从而发生核酸片断水平上的重新组合，这种现象称为基因重排。在抗原漂变和抗原转变的共同作用下，流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)能够不断进化获得更高的识别唾液酸、膜融合蛋白等活性，达到HA与NA活性新的平衡，从而具有更强的感染力、复制力。

4.1血凝素(HA)与致病性的关系（1）HA受体对致病性的影响HA受体是宿主细胞表面含唾液酸(sA，又称N一乙酞神经氨酸)结尾寡糖链的糖蛋白和糖脂，唾液酸是A型和B型流感病毒受体表面必须具备的基本成分，有a-2，3-半乳糖-N-乙酞神经氨酸和a-2，6-半乳糖-N-乙酞神经氨酸两种。连有a-2，3-半乳糖-N-乙酞神经氨酸的糖蛋白和糖脂是禽流感病毒受体，多存在于禽类的呼吸道和肠道黏膜上皮，以及人类下呼吸道的支气管和其前端的肺泡细胞上。而连有a-2，6-半乳糖-N-乙酞神经氨酸的糖蛋白和糖脂是人类普通感冒病毒(B型流感病毒)的受体，多存在于人类咽喉和鼻腔的细胞表面[11]。禽流感病毒感染的第-步就是其HA蛋白与宿主细胞上的受体结合，其宿主范围与存在于宿主体内的a-2，3-半乳糖-N-乙酞神经氨酸寡糖受体分布有关[12]。此外，许多动物血清中含有HA受体的竞争抑制剂，也是影响流感病毒宿主特异性和致病力的一个重要因素。（2）HA裂解位点结构对致病性的影响禽流感病毒HA蛋白前体裂解为HAl和HA2在病毒入侵细胞及决定病毒致病力方面起着关键作用。HA裂解位点上碱性氨基酸的多少和宿主体内蛋白裂解酶的分布是影响其裂解的主要原因[13]，也是影响病毒致病能力及其在机体内扩散能力的主要因素。低致病力禽流感病毒在HA裂解位点上只有1个或2个碱性氨基酸，均为精氨酸，这种结构只能被存在于呼吸道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解。而高致病力禽流感病毒HA裂解位点具有多个碱性氨基酸，可被机体大多数组织细胞内的蛋白酶识别并裂解[14]，具有广泛的嗜细胞性。因此，低致病力禽流感病毒感染一般只在呼吸道和消化道内局部繁殖。而高致病力禽流感病毒一旦进入机体就会迅速扩散，导致全身多个组织发病并死亡。

4.2神经氨酸酶(NA)与致病性的关系NA是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，是由4个亚基组成四聚体。主要结构包括胞浆尾部、跨膜区、杆部和球状头部4个部分。其中头部具有水解酶活性，可水解感染细胞表面糖蛋白末端的神经氨酸与相邻糖基的а2糖苷键，切除病毒表面和感染细胞表面的唾液酸。NA的作用有三方面：（1）破坏细胞膜上的病毒特异性受体，使病毒从感染细胞膜上释放；（2）可以防止新生病毒的自身凝集，允许病毒扩散并增强其感染能力；（3）NA还可促进病毒从呼吸道黏液向周围组织扩散。NA可以影响宿主细胞对HA的裂解活性，NA与HA之间的平衡会影响到流感病毒对靶细胞的感染与释放。流感病毒AZWSN/33对小鼠具有高致病性就是因为该病毒的NA可以和细胞的纤溶酶原结合并解离，这一过程激活了纤溶酶原使之水解为纤溶蛋白酶，这种蛋白酶可以裂解HA。NA与纤溶酶原结合需要在NA的C末端包含Lys。到目前为止还没有发现其他流感病毒的NA可以与纤溶酶原结合。NA也可以通过其他途径影响流感病毒的致病性，增加NA上糖基化位点可导致H5N1亚型流感病毒对鸡的致病性增强[15]。

4.3聚合酶与致病性的关系流感病毒的RNA聚合酶分为PBl、PB2、PA3个亚基。其中，PBl亚基具有RNA聚合酶活性，既参与mRNA转录又参与vRNA复制，同时连接PB2与PA。PB2亚基具有识别宿主mRNA并切割其5’帽子结构内切酶活性，同时具有3’-5’核酸内切酶的活性，负责校对功能[16]。PA功能尚不清楚，可能参与vRNA复制。在流感病毒的3个聚合酶中，对PB2基因与该病毒致病性的关系研究最为深入。如从1997香港禽流感感染者分离到的两株流感病毒HA均具有多个碱性氨基酸组成的裂解位点。但对小鼠的致病性却完全不同，A/Hong Kong/483/97对小鼠是高致病性的，可造成小鼠的全身性感染并致小鼠死亡。而A/HongKong/486/97则只引起非致死性呼吸道感染。Hatta等[17]通过突变分析证实，这两种病毒的致病性强弱与PB2上627位氨基酸有关。在627位上具有Lys的A/Vietnam/1203/04对雪貂具有高致病性，2004年从鹌鹑体内分离到的H5N1亚型流感病毒在627位上是Glu，其对雪貂也具有高致病性[18]。关于PB2基因627位氨基酸的作用与功能，有两个假设：①该位置上的氨基酸决定了病毒聚合酶与宿主必需因子间的相互作用；②该位置上的氨基酸与病毒RNA聚合酶在不同温度下的活性有关。病毒在禽类和哺乳动物中复制时是处于不同温度下的，人流感病毒在上呼吸道复制时所处的温度约为30cI=，禽流感病毒在禽类的肠道中复制时所处的温度则约为41℃。在哺乳动物细胞内，来源于禽流感病毒的聚合酶复合物在30℃时的活性要低于在41℃条件下。

4.4细胞因子与致病性的关系Seo等[16]研究认为，细胞遭到流感病毒袭击后，通常会释放出被称为“细胞因子”的免疫分子，激发免疫系统攻击病毒，保护未受感染的细胞。但是，细胞因子对引起禽流感的H5N1病毒无任何反应。并认为1997年肆虐我国香港的H5N1 AIV能够靠1个变异基因掩藏自己，躲避人体免疫系统的攻击。这个特殊的基因即非结构基因，其分子的第92位为谷氨酸，它使该病毒具有躲避免疫系统攻击的能力[19]。有人将此基因移植人另一种AIV(H1N1)，用来感染试验，结果发现，被改造的病毒感染的动物发病症状比未改造的病毒感染的要严重得多，病情持续时间更长。

5　禽流感病毒的药物研发及疫苗研制

使用抗病毒药物是降低禽流感发病率及死亡率的重要手段之一。据文献报道，M2离子通道抑制剂(adamantanes)和神经氨酸酶抑制剂(oseltamivir和za-namivir)对流感病毒均有较好的抑制作用(Gubareva etal.，2000)。神经氨酸酶抑制剂的作用主要是抑制病毒感染细胞，同时能干扰病毒从细胞内释放的过程。使用抗病毒药物的一般原则是越早越好。如果在病毒感染引起的临床症状出现很长一段时间后再用药，则抗病毒的效果往往不佳。抗病毒药物存在的一个普遍问题是长期服用后会诱导产生耐药的变异株。多年来的研究表明对易感人群进行大面积疫苗接种可以有效地预防流感病毒感染、减轻临床症状及降低死亡率[20]。因此开发和研制有效的HPAIV疫苗亦是预防禽流感的重要一环。一般来讲，如果AIV的疫苗株与流行变异株的免疫原性越接近时，则由疫苗接种所产生的对机体的保护作用也就会越强。目前世界上大多采用灭活AIV疫苗(Horimoto and Kawaoka，2006)。同时也有人尝试DNA疫苗(Forde，2005)以及利用反向遗传的手段来研制禽流感疫苗(Neumann etal.，1999; Hoffmann et al.，2000; Neumann et al.，2005)。禽流感病毒研究概述Current Research on Avian Influenza Viruses197基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology自2005年起，我国已开始对禽类实行强制性的疫苗接种以图预防HPAIV(H5N1亚型)的感染。在墨西哥，LPAIV(H5N2亚型)疫苗已用于免疫鸡群来预防AIV的感染(Swayne et al.， 1997; Capua and Marngoan，2003)。流感病毒基因的高度变异性常会使流感病毒疫苗生产株与流行株的抗原性不相吻合，使得疫苗对流感病毒流行株的免疫预防效果欠佳。目前世界上有些国家已开始致力于研制流感通用疫苗(deFilette et al.，2005)。这种疫苗从理论上来讲可以使接种的人群抵御多种流感病毒亚型变异株的感染，它代表着今后新型禽流感疫苗研发的趋势之一。

6　结语

自从1997年在香港首次发现高致病性禽流感病毒(HPAIV)可以直接感染人后，世界上的其它国家也陆续出现了一些HPAIV感染人的病例。HPAIV感染人能引起呼吸系统受损，严重的甚至可以造成患者死亡。AIV在被感染的禽类体内不断发生基因突变或基因重配，为禽流感在人群中的流行创造了必要的条件。从分子生物学的角度对HPAIV的毒力、细胞嗜性、宿主范围、致病机制以及流行规律进行深入探究，将会使我们对HPAIV的生活周期及繁殖特性有更为清晰的了解，为抗HPAIV药物及疫苗的研制提供坚实的科学依据。相信经过世界各国科学家们长期不懈的共同努力，人们将会在未来研制出快速鉴别HPAIV亚型的诊断试剂同时生产出高效的抗HPAIV药物及疫苗，为防止禽流感在世界范围内的大流行做好充分的理论、物质和技术储备。

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（2016–08–11）