分子生物学方法在鉴定双歧杆菌中的应用

田亮，卢勉飞，蔡芷荷，吴清平，李艳嫦，李兴

（1.广东环凯微生物科技有限公司，广东广州510663；2.广东省微生物研究所，广东广州510663）

分子生物学方法在鉴定双歧杆菌中的应用

田亮1，卢勉飞1，蔡芷荷1，吴清平2，*，李艳嫦1，李兴1

（1.广东环凯微生物科技有限公司，广东广州510663；2.广东省微生物研究所，广东广州510663）

依靠传统生理生化、菌落表观形态等鉴定双歧杆菌，很难区分生化相近的菌株，例如双歧杆菌和婴儿双歧杆菌或者动物双歧杆菌和乳酸双歧杆菌，这给食品风险监测和卫生监督带来严峻的挑战。随着分子生物学方法的成熟，大量分子生物学方法成为了鉴定双歧杆菌种属高效的鉴定方法，这些分子生物学方法包括16SrRNA基因序列、小分子保守序列hsp60、多重PCR、核糖体DNA序列扩增片段限制性内切酶分析（ARDRA）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）以及能够对样品中双歧杆菌进行鉴别和定量的实时荧光定量PCR技术。本文对分子生物学方法在鉴定双歧杆菌的应用进行了综述。

双歧杆菌；hsp60；鉴定；序列

有研究表明，在不同年龄段人群的肠道中，分布有不同种属双歧杆菌。婴幼儿时期，正常菌群中双歧杆菌主要是两歧双歧杆菌（Bifidobacteriabifidum），长双歧杆菌（B.longum），婴儿双歧杆菌（B.infantis）和短双歧杆菌（B.breve）［1］。在成人时期，双歧杆菌的组成演变为青春双歧杆菌（B.adolescentis），长双歧杆菌（B.longum），两歧双歧杆菌（B.bifidum），链状双歧杆菌（B.catenulatum）以及星状双歧杆菌（B.pseudocatenulatum）［2］。双歧杆菌作为益生菌，可以改善人体的多种生理功能，提高机体的免疫能力以及调节人体正常菌群［3］。因此，市场上的益生菌产品越来越多，质量参差不齐，对这些益生菌产品进行风险检测需要快速、高效的鉴定方法。

双歧杆菌的鉴定主要是通过菌落形态、糖类发酵反应以及测定酶活等进行。但是这些经典的传统鉴定方法耗时，费力，不能区分种属关系亲近的种，尤其是益生菌产品中含有婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌或者动物双歧杆菌和乳双歧杆菌。随着分子生物学技术的成熟应用，分子生物学方法具有明显的优势：鉴定快速，结果准确等［4］。本文对这些分子生物学方法进行了综述。

1多重PCR（MultiplexPCR）方法在鉴定双歧杆菌种的应用

普通PCR一般只有1对引物进行核酸序列的扩增，而多重PCR采用了多对引物进行核酸序列扩增，可以同时鉴定多个细菌的种属关系以及多个基因型等。

进行多重PCR操作要注意一下几点：第一，所有引物的退火温度在同一个范围内；第二，引物之间不能产生交叉反应；第三，不同大小的PCR产物片段可以区分细菌的种属关系；第四，多重PCR需要的Taq酶的量比普通的PCR需要的酶量大。

多重PCR的引物一般是基于16S rRNA、23S rRNA的内部保守间隔序列［5］。Dong等设计了5对双歧杆菌种水平的特异性引物，这5对引物分别是两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌的16SrRNA基因序列特异性不同结合位点的序列。研究结果表明，这5对引物能够从种水平上区分人肠道的两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌［6］。Bonjoch等基于16S rRNA基因序列设计了齿双歧杆菌（B.dentium）和青春双歧杆菌特异性鉴定引物。Bonjoch等首先利用lm26和lm3引物鉴定双歧杆菌属，然后将扩增产物利用种特异性引物进行扩增，从22份人源生活污水分别检出青春双歧杆菌和齿双歧杆菌的鉴定率为100%和77.2%。该研究指出多重PCR方法的检测限为10 cfu/mL［7］。

2小分子基因保守序列在鉴定双歧杆菌中的应用

随着基因组学和蛋白质组学的快速发展，研究人员发现了更多的保守基因序列尤其是编码蛋白质的基因序列用于对未知微生物的鉴定。Stenico等指出利用小分子基因保守序列对双歧杆菌属进行分类鉴定，鉴定结果的准确性甚至比依靠16S rRNA基因序列鉴定的准确性高，该研究组将小分子扩增和限制性内切酶技术相结合，建立了利用小分子鉴定双歧杆菌的新方法［8］。在鉴定双歧杆菌属时，研究人员发现编码蛋白质的基因序列：ldh（L-lactate deshydrogenase gene）、recA、hsp60、丙酮酸激酶基因（Pyruvate kinase gene，pk）存在高度保守区域，根据这些高度保守区域设计引物，进行序列扩增并测序，通过基因序列比对对未知双歧杆菌进行鉴定［9］。研究人员研究了用recA和ldh鉴定已经添加在商业化产品中的人源双歧杆菌：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌和从母乳喂养的婴儿粪便中分离的双歧杆菌，研究发现在分析ldh基因的时候，发现乳双歧杆菌DSM 10140和动物双歧杆菌ATCC27536的ldh基因具有很高的相似性，但是ldh基因在乳双歧杆菌DSM 10140和动物双歧杆菌ATCC25527T之间保持了一定差异［10］。Vaugien等指出丙酮酸激酶基因能够鉴定区分婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌，也能够区分动物双歧杆菌和乳酸双歧杆菌［11］。Jian等研究指出了hsp60基因序列能够鉴定人源所有双歧杆菌属［8］，链状双歧杆菌和假链状双歧杆菌（B. pseudocatenulatum）之间hsp60基因序列的相似性为93%，长双歧杆菌，婴儿双歧杆菌和猪双歧杆菌（B.suis）之间hsp60基因序列的相似性为98%，动物双歧杆菌和乳酸双歧杆菌hsp60基因序列的相似性为98%。因此，由于hsp60的高度保守性和特异性，hsp60基因在构建双歧杆菌分子系统发育树方面比16S rRNA基因序列构建的发育树更具有优势。

综上所述，利用克隆扩增小分子特异性序列进行比对构建分子进化发育树鉴定人源双歧杆菌是比利用16S rRNA基因序列更具有优势。

3ARDRA技术在鉴定双歧杆菌中的应用

ARDRA（Amplified ribosomal DNA restriction analysis）技术也称之为核糖体DNA序列扩增片段限制性内切酶分析，该技术是新一代对未知微生物进行鉴定的技术，主要是利用rDNA序列的保守性，对rDNA序列进行扩增，酶切，依据得到的酶切图谱对种属的多样性分析。该技术的具体步骤是细菌经过培养，并提取DNA序列，利用PCR技术对16S rRNA基因序列进行局部或者整个片段扩增，扩增产物用限制性内切酶进行消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切图谱［11］。不同种属的细菌有不同的酶切图谱，每个种属细菌的酶切图谱都有特异性。因此，利用多种限制性内切酶的图谱可以鉴定种属关系更近的种［12］。Roy and Sirois为了鉴定动物双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌，扩增了16S rRNA基因的部分片段，大小为914 bp，然后利用限制性内切酶：BamHI，Sau3AI和TaqI对扩增产物进行酶切，分析酶切图谱。该研究指出，长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌除了限制性内切酶Sau3A1酶切图谱有不同，其它酶切图谱基本一致。Ventura扩增了16S rRNA基因序列之后，用BamHI和Sau3AI酶切，酶切图谱也证实了Roy and Sirois的研究。Ventura研究指出，链状双歧杆菌和假链状双歧杆菌也可以用BamHI and Sau3AI酶切图谱进行鉴定。Venema and Maathuis扩增了目前已知的人源性的14种双歧杆菌以及动物双歧杆菌和乳双歧杆菌的16S rRNA基因序列片段，片段大小为511 bp到525 bp不等，扩增产物利用6个限制性内切酶：TaqI，Sau3AI，RsaI，AluI，Sau96I和NciI对扩增的16S rRNA基因序列片段进行酶切，每种双歧杆菌的酶切图谱都呈现了种属特异性［13］。因此，ARDRA技术是鉴定人源性双歧杆菌方法中一种较为可靠的方法。

4变性梯度凝胶电泳技术在鉴定双歧杆菌方面的应用

20世纪80年代，Lerman等发明了变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），主要是用于研究DNA序列序列片段中碱基发生变异，由于该技术灵敏度高，多用于研究DNA序列片段的点突变［14］。该技术多用于遗传病、癌症等的筛查以及微生物分子生态学研究。变性梯度凝胶的基本分离原理是在聚丙烯酰胺凝胶中加入了尿素、甲酰胺等变性剂梯度，根据不同的DNA序列片段的熔解温度不同实现DNA序列片段的分离。最先解链的DNA序列片段在凝胶电泳中迁移速率会变慢。当变形剂的浓度升高时，其它解链区DNA序列双链开始解链。不同的DNA序列双链由于其碱基序列不同，其解链性质也不一样，在凝胶电泳时其迁移速率也不一样。

Satokari等在2001年基于双歧杆菌的16SrRNA基因序列设计了种属特异性引物进行PCR，扩增产物进行DGGE，成功的对人粪便中双歧杆菌的群落特征进行了研究［15］。Requena等对16SrDNA序列的V2-V3区域进行了PCR扩增，成功的区分了动物双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、假链状双歧杆菌和短双歧杆菌［16］。PCR-DGGE技术利用特异性引物进行PCR序列扩增，扩增产物进行DGGE和测序，这种方法能够快速的鉴定和筛选益生菌商品中益生菌的菌落构成。

5PFGE技术在鉴定双歧杆菌种的应用

脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis）主要是用来分离大分子DNA序列片段的。普通的琼脂糖凝胶电泳只能对小分子DNA序列片段进行分离，对于大于10 kb的DNA序列片段由于其迁移速率基本一致，不能区分大分子量的DNA序列条带。在脉冲场电泳中，电场不断在两个不同的方向上改变，带负电荷的DNA序列片段向负极迁移。较小分子量DNA序列片段在电场改变时很容易产生方向的改变，而较大分量的DNA序列方向转换较慢，其泳动速率也逐渐变慢，因此，不同分子量的DNA序列分子可以分开。

在鉴定双歧杆菌的应用中，脉冲场凝胶电泳重复性好，能够很好的将双歧杆菌各个种属区分［17］。脉冲场凝胶电泳和其它的分子生物学方法相比，脉冲场凝胶电泳花费时间，另外需要提取完整的基因组DNA序列。从含有益生菌的食品中分离双歧杆菌并提取了基因组DNA序列，用限制性内切酶Xbal和Spel进行消化进行脉冲场凝胶电泳，最后分析脉冲场凝胶图谱。在益生菌中样品中含有两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌等多种双歧杆菌，利用PFGE的方法可以提高鉴定正确率［18］。

6实时荧光定量PCR的应用和发展

实时荧光定量PCR是鉴定或者定量检测微生物的高效快速的方法，而且其灵敏度比普通的PCR要高，每次PCR循环完成之后，荧光剂就对扩增产物的量进行检测。实时荧光定量PCR使用内参或者外参为对照，对PCR过程或者扩增产物进行分析，根据数学模型，确定PCR初始模板量。在实时荧光定量PCR中经常使用的荧光物质为荧光定量染料SYBR Green和荧光探针Taqman。

在荧光染料检测循环过程中，DNA序列片段经历热变性，在退火的过程中，在DNA序列聚合酶的作用下引物开始进行延伸，SYBR Green此时结合在DNA序列双链之间，受激发后产生荧光。Monique Haarman利用实时荧光定量PCR对喂食益生元婴儿的粪便进行双歧杆菌生物群落构成研究并进行了定量分析［19-20］。

荧光探针的特异性要比荧光定量染料的特异性高，而且荧光探针可以进行多重反应。荧光探针的特异性受到GC含量，溶解温度和探针长度的影响。Taqman探针类实时荧光定量PCR在设计探针时，在探针的3’端标记了荧光淬灭基团，在探针的5’端标记了荧光基团。由于完整的探针带有荧光淬灭基团，因此，探针没有荧光，当3’端淬灭基团被内切酶消化后，淬灭基团与荧光基团分离，在激光的激发下，荧光基团产生荧光。探针的DNA序列序列是与目的片段的DNA序列序列互补，然后由于Taq酶具有5’-3’外切酶的作用，探针段裂，激光激发产生荧光。Yang等利用实时荧光定量PCR扩增了人体分离的双歧杆菌的耐酸性相关的RNA序列，保证了序列的精准度，研究发现耐酸性双歧杆菌可以通过基因修饰等策略提高菌株的耐酸性［21］。

随着定量PCR技术的发展，不段发现新的荧光物质：分子信标探针和Scorpions引物。分子信标是DNA序列形成发卡结构，一端带有荧光基团，另外一端带有荧光淬灭基团，当单链DNA序列为发卡结构时，两种基团距离较近，产生荧光信号能量共振转移。当达到熔解温度时，DNA序列的发卡结构消失，荧光信号能量共振转移随着消失，荧光基团发出荧光。分子信标方法的灵敏度比探针型的高，目前主要用于临床检验基因的点突变、胚胎性别等。

Scorpions引物是既含有引物，又结合了荧光探针。在正常情况下，荧光探针形成了发卡结构，荧光基团和淬灭基团距离较近不能产生荧光，而在变性阶段，发卡结构消失，在聚合酶的作用下，与模板结合后进行延伸，荧光基团发出荧光，其荧光强度比上述的荧光物质都高，因此，具有良好的应用前景。

7展望

由于双歧杆菌的益生作用，长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短型双歧杆菌等已经应用在大量的产品：酸奶、奶粉、冰激凌以及临床上治疗婴幼儿消化不良的药物中。对这些产品进行风险检测，需要快速、高效的鉴定方法，分子生物学方法能够实现这些检测的要求。

目前大规模应用的分子生物学方法都是基于16S rRNA基因保守序列对双歧杆菌进行鉴定，这些方法的灵敏度和特异性比较高，然而不能对样品或者益生菌产品中的双歧杆菌定量检测［22］。PFGE方法是基于基因组经过限制性酶切之后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据不同种属双歧杆菌的电泳图谱不同对未知双歧杆菌进行鉴定，但是这种鉴定方法的特异性较差，利用PFGE方法区分鉴定婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌具有一定的难度。而实时荧光定量PCR既能够对益生菌产品或者样品中含有的双歧杆菌种属鉴定，又能定量检测双歧杆菌［23-24］，在未来鉴定和筛选双歧杆菌的方面能够发挥更大的作用。

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Application of Molecular Biology Methods in Identification of Bifidobacterium

TIAN Liang1，LU Mian-fei1，CAI Zhi-he1，WU Qing-ping2，*，LI Yan-chang1，LI Xing1
（1.Guangdong Huankai Microbial Sci.&Tech.Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，Guangdong，China；2.Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

It is difficult to identify similar bifidobacteria of biochemical characteristics based on physiological and biochemical property，phenotypic patterns，such as distinction between Bifidobacterium longum and Bifidobacterium infantis or Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactisis.There are a lot of molecular methods to identify Bifidobacterium sp.including 16SrRNA，hsp60，multiplex PCR，amplified ribosomal DNA restriction analysis（ARDRA），denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE），and pulsed-field gel elec trophoresis（PFGE）.Real-time PCR or Q-PCR which will be soon an interesting tool for the detection，identification and quantification of Bifidobacteria spp.In this review，molecular methods for the detection，identification and quantification of Bifidobacteria sp.are outlined.

Bifidobacteria；hsp60；detection；sequence

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.049

2016-01-20

广东省科技项目（2012A070500033）

田亮（1984—），男（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：食品微生物。

吴清平（1962—），男，研究员，博士，研究方向：食品微生物。