植物ICE蛋白基因家族的系统进化分析

陈露 杨立明 罗玉明

摘要：ICE是植物体内的一类bHLH转录因子，在植物低温胁迫中发挥重要作用。本研究利用来自不同物种包括苔藓、蕨类、裸子、被子植物的ICE蛋白序列，用Clustal X程序对其氨基酸序列进行比对，并用邻近法构建系统进化树，进一步了解ICE家族在植物界的分子进化情况。结果表明，ICE蛋白家族基本上按苔藓、蕨类、裸子、单子叶和双子叶植物而分别聚类，尽管不同来源的ICE序列有一定差异，但HLH结构域在各植物物种中具有很好的保守性，这说明ICE蛋白在进化上具有保守性；被子植物的ICE形成不同的分支，单子叶植物和双子叶植物原始的ICE蛋白有可能不同。

关键词：植物；ICE；序列比对；系统进化分析

中图分类号： Q943.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）02-0042-06

收稿日期：2015-02-27

基金项目：国家高技术研究发展计划（编号：2013AA102705）；国家自然科学基金（编号：30900871）；江苏省自然科学基金（编号：（BK2011409）。

作者简介：陈露（1989—），女，江苏靖江人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。E-mail：chenlu1201@163.com。

通信作者：罗玉明（1963—），男，江苏涟水人，教授，研究生导师，主要从事植物生物技术研究。Tel：（0517）83525128；E-mail：yumingluo@163.com。

ICE（inducer of CBF expression）是CBF[C-repeat-binding factors，又称DREBs（dehybration responsive element factors）]冷响应通道的上游调控因子，目前主要在拟南芥中发现[WTBX][STBX]ICE1和ICE2[WTBZ][STBZ]这2种ICE基因。ICE一般为组成型表达，常温下没有活性，低温诱导可使[WTBX][STBX]ICE1[WTBZ][STBZ]成活性状态，编码一个类似MYC的螺旋-环-螺旋型（bHLH）转录激活因子，诱导CBF基因的表达，从而提高植物的抗寒性，在转基因植株生长发育过程中没有异常表现[1]。研究表明，ICE2可以直接影响[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因的表达，将[WTBX][STBX]ICE2[WTBZ][STBZ]基因转入拟南芥发现，拟南芥体内[WTBX][STBX]CBF1[WTBZ][STBZ]基因表达量明显上升，转基因拟南芥可在-20 ℃环境下正常生长[2-3]。由此可见，ICE在植物低温抗性中有着重要的作用。有研究证明，ICE1-CBF转录级联反应在植物响应低温胁迫过程中发挥着至关重要的作用[4]。

目前，依赖CBF的信号转导通路被视为植物低温胁迫应答的主要途径[4-7]。在ICE1-CBF的调控路径中，ICE1在低温诱导下与CBF3启动子顺式作用元件相互结合，并激活CBF3转录，调控CBF及下游抗冷相关基因的转录，也可以与R2R3型MYB转录因子AtMYB15相互作用，负调控CBF基因的表达[2，8]。ICE1蛋白的磷酸化可能涉及到低温胁迫过程中ICE1的活性调控。另外，HOS1编码一种E3连接酶，参与ICE1蛋白的泛素化降解，在低温胁迫过程中，HOS1与ICE1相互作用并降解ICE1，通过ICE1调节CBF的转录。有研究表明，ICE1蛋白在冷胁迫时明显降解，而在HOS1突变体中，ICE1蛋白受冷胁迫降解的程度明显降低[9-10]。

鉴于ICE在植物低温抗性中的重要作用，本研究通过对来源于植物的ICE蛋白进行同源比对，分析系统发生关系，拟找出ICE基因在植物界的系统进化关系，为研究该基因的功能进化提供参考。

1材料与方法

1.1序列信息的获取与筛选

为获得ICE家族的各成员，分别以拟南芥ICE基因的蛋白质序列AtICE1、AtICE2，使用Blastp程序搜索绿色植物数据（http：//blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），database选择为non-redundant protein sequences （nr），organism选择为plants（taxid：3193），max target sequences设置为250，其余均为默认参数。对获得的搜索结果用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进行分析，把具有与拟南芥ICE基本结构特征的序列保留下来做后续分析。

1.2多序列比对及系统进化树的构建

以氨基酸全序列比对结果为基础，用Mega 5.10软件构建系统进化树[11]。采用Neighbor-joining法运行相应参数[12]：Poisson model模式，缺口设置为Pairwise deletion；校验参数为bootstrap=1 000。系统发生树中，ICE家族各亚族的分组是在相似理论和分类学基础上完成，并用Clustal X软件[13]进行检验。

1.3模体识别

使用MEME模体搜索工具以识别ICE家族相关蛋白质所共有的模体，并对相关参数进行修改，将可找到的模体最大值调整为25，每个模体的最大宽度调整为100，其他均为默认值；MEME在线软件识别的模体通过Smart和Pfam模体识别工具[14-15]进行进一步检验。

2结果与分析

2.1植物ICE基因的鉴定

利用模式植物拟南芥中已测序的2个ICE蛋白基因序列，执行Blastp搜索、关键词搜索、结构域搜索等，以在植物中获得更多的ICE基因；将得到的初始目标序列经过整理、合并、筛选，通过Mega 5.10软件构建系统进化树，并进行逐一比对分析，去除不符合条件的序列，最终确定33个植物（表1）基因组中的65个ICE蛋白质基因（表2）用于分析，其中包括拟南芥2个模板ICE蛋白基因。按照从低等植物到高等植物的顺序依次为：2条来自苔藓植物，即藓纲的小立碗藓；2条来自蕨类植物，即石松纲的江南卷柏；1条来自裸子植物，即松柏纲的北美云杉；21条来自单子叶植物的禾本科和芭蕉科，包括山羊草、小麦、乌拉尔图小麦、水稻、二穗短柄草、大麦、玉米、芭蕉共8种植物；39条来自双子叶植物，包括芥菜、欧洲油菜、蓖麻、大白菜、山嵛菜、板蓝根、荠菜、拟南芥、萝卜、白刺、桉树、蓝桉树、葡萄、鹰嘴豆、大豆、野茶树、番茄、黄瓜、野草莓、榛子、甜杨、毛果杨共22种植物。

2.2序列特异性分析

由图1可见，65个ICE蛋白质基因中，有63、63、61、62、63个基因分别包含模体1、模体2、模体3、模体5和模体6；基因GmICE5、GmICE1-like2缺失模体1，基因GmICE5、GmICE6缺失模体2，基因GmICE5、GmICE6、HvICE2-3、PsiICE1缺失模体3，基因GmICE5、MuICE1-3、MuICE1-1缺失模体5，PpICE1、PpICE2缺失模体6。利用NCBI中Blastp对65个植物的ICE氨基酸序列进行结构域搜索，结合MEME做出蛋白序列25个模体（表3）中的模体2、模体3序列进行分析，并用Smart和Pfam进行检验，结果表明，不同来源的ICE氨基酸序列有一定的差异，但仍有一个保守结构域HLH存在，HLH是ICE氨基酸序列的功能区域，包含3个功能位点，分别为DNA结合区域（核酸结合位点）、E-box （5-CANNTG-3）/N-box （5-CACGC/AG-3）的特异性位点、二聚接口（多肽结合位点）。

2.3植物ICE基因家族的系统发生关系

由图2可见，ICE蛋白家族基本按苔藓、蕨类、裸子、单子叶和双子叶植物而分别聚类，说明该基因在进化上具有保守性；大部分允许ICE蛋白亚族分离的节点，自展值都比较小；自上往下，将ICE家族分为4个亚组，分别被称为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、

Ⅳ，其中第Ⅰ大亚组包含所有双子叶植物，第Ⅱ大亚组全部为单子叶植物，第Ⅲ大亚组可分为2个小亚组A、B，其中，小亚组A全部为单子叶植物，小亚组B为裸子植物，第Ⅳ大亚组可分为2个小亚组C、D，其中，小亚组C为蕨类植物，小亚组D为苔藓类植物；Ⅲ和Ⅳ位于系统发生树的基部，其在进化地位上是最原始的类型。

3结论

对植物ICE蛋白基因家族进行分析发现，尽管不同来源的ICE序列表现出一定的差异，但HLH结构域在各植物物种中都有很好的保守性，这说明该基因在进化上具有保守性。对双子叶植物来说，大多数同源基因聚类到一起，如 BrICE1-1 和BrICE1-2，VvICE1-1和VvICE1-2，GmICE5、GmICE6、GmICE1-like1、GmICE2、GmICE1、GmICEb、GmICE4和GmICEd，GmICE1-like2和GmICE3，CsiICE1和CsiICE2，PsuICE1和 PsuICE1；对单子叶植物、蕨类植物、苔藓植物来说，也发生同样的现象。这说明植物ICE蛋白基因家族的进化模式， 应归因于物种特定的扩张，也可以说，植物进化历程

中，细胞扩增过程中的基因复制及细胞分化是ICE蛋白基因家族的主要进化模式。因此，进化树分支末端的基因可能是代表最近复制过程中突变的基因[16]，这为物种特定扩张学说提供了有力支持。同时，研究发现，被子植物中的ICE基因形成不同的分支，这表明单子叶植物和双子叶植物可能有不同的原始ICE蛋白基因。

[HS2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

[1][ZK（#]郑银英，崔百明，常明进，等. 转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究[J]. 西北植物学报，2009，29（1）：75-79.

[2]Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，et al. ICE1：a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Genes & Development，2003，17（8）：1043-1054.

[3]王翠花，刘沙，张瑞富，等. 植物抗寒分子生物学研究概况及展望[J]. 辽宁农业科学，2014（1）：45-48.

[4]Chinnusamy V，Zhu J H，Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants[J]. Trends in Plant Science，2007，12（10）：444-451.

[5]Zhu J H，Dong Ch H，Zhu J K. Interplay between cold-responsive gene regulation，metabolism and RNA processing during plant cold acclimation[J]. Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：290-295.

[6]Chinnusamy V，Zhu J K，Sunkar R. Gene regulation during cold stress acclimation in plants[J]. Methods in Molecular Biology，2010，639：39-55.

[7]Zhou M Q，Shen C，Wu L H，et al. CBF-dependent signaling pathway：a key responder to low temperature stress in plants[J]. Critical Reviews in Biotechnology，2011，31（2）：186-192.

[8]Agarwal M，Hao Y J，Kapoor A，et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281（49）：37636-37645.

[9]Dong C H，Hu X Y，Tang W P，et al. A putative Arabidopsis nucleoporin，AtNUP160，is critical for RNA export and required for plant tolerance to cold stress[J]. Molecular and Cellular Biology，2006，26（24）：9533-9543.

[10][ZK（#]Dong C H，Agarwal M，Zhang Y Y，et al. The negative regulator of plant cold responses，HOS1，is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（21）：8281-8286.

[11]蒋瑶，陈其兵. 植物CBF1转录因子的生物信息学分析[J]. 林业科学，2010，46（6）：43-50.

[12]王波，孙君社，翟玉盼，等. 植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族的分子进化分析[J]. 生物技术通报，2011（1）：83-89，94.

[13]金谷雷，汪旭升，朱军. 水稻14-3-3蛋白家族的生物信息学分析[J]. 遗传学报，2005，32（7）：726-732.[HJ]

[FK（W46][TPCL222.tif；S+2mm][FK）]

[14][ZK（#]Schultz J C R，Bork P. Smart：a web-based tool for the study of genetically mobile domains[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：231-234.

[15]Sonnhammer E R，Durbin R. Pfam：a comprehensive database of protein domain families based on seed alignments[J]. Proteins，1997，28（3）：405-420.

[16]Xiong Y Q，Liu T Y，Tian C G，et al. Transcription factors in rICE：a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots[J]. Plant Molecular Biology，2005，59（1）：191-203.