白花拟万代兰（Vandopsis undulata）组培苗的增殖、生根与炼苗

林夏斌++黄华达++黄怀妹+++彭东辉+++翟俊文+++吴沙沙

摘要：白花拟万代兰（Vandopsis undulata）花大素雅，具芳香，有很高的观赏价值，并有很大的市场前景。为缩短白花拟万代兰从无菌播种到成苗的时间并保证组培苗移栽成活率，以无菌播种获得的白花拟万代兰小苗为材料，合并其增殖和生根阶段最适培养基的筛选，继而对最适移栽基质进行了筛选研究。结果表明，丛生芽增殖的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA +250 mL/L 椰子汁，平均增殖系数达3.57；丛生芽生根培养的最佳培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+50 mL/L椰子汁；所用移栽基质中，泥炭土和木屑对白花拟万代兰栽培成活率有显著影响，最优的基质体积配比为：苔藓 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠岩 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

关键词：白花拟万代兰；组织培养；移栽基质；6-BA；NAA

中图分类号： S682.310.4+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）02-0056-04

收稿日期：2015-09-08

基金项目：福建省特色花卉品种创新与种苗设施繁育产业（编号：2014S1477-7）。

作者简介：林夏斌（1990—），男，硕士研究生，主要从事园林植物应用研究。E-mail：xiabinlin1916@126.com。

通信作者：吴沙沙，博士，讲师，从事园林植物资源与应用研究。E-mail： shashawu1984@126.com。

白花拟万代兰（Vandopsis undulata）为兰科（Orchidaceae）拟万代兰属典型的热带附生兰，产中国云南南部至西北部（勐海、腾冲和怒江河谷）、西藏东南部（墨脱、背崩），生于海拔1 800～2 200 m的林中树干上，尼泊尔、锡金、不丹和印度东北部也有分布[1]。在兰科植物中，拟万代兰属约5种，目前，均未实现工厂化生产供应市场，野外资源急需保护和人工扩繁[2]。白花拟万代兰花大素雅，具芳香，有很高的观赏价值，具有很大的市场前景。拟万代兰属约有5种，中国仅有拟万代兰（V. gigantea）和白花拟万代兰2个种。兰科植物单个果实种子量大是其显著优势，利用种子进行大规模繁殖是对保护兰科植物的重要手段[3]。兰花种子又称种胚，其细如粉尘，只有在显微镜下才能看清，没有胚乳，处于原胚阶段，缺乏营养[4-5]，多数兰科植物依靠其自身营养则难于萌发，因此外源营养对兰花种子的萌发显得尤其重要[6]。传统的繁殖方式，繁殖系数低、速度慢[7]，不能满足日益增长的市场需要。找到一个快速繁殖种苗的方法对其种质资源的保护和开发利用将具有重要的现实和理论意义。

本试验采用不同培养基配方、栽培基质，对白花拟万代兰增殖、生根及组培苗移栽成活率进行了研究，探讨在无菌培养、移栽过程中不同因素对其成活、生长发育的影响，以期获得最适宜的无菌培养配方和移栽条件，为提高白花拟万代兰的繁殖系数，获得大量优质组培苗提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

2013年9月，对购自云南腾冲的白花拟万代兰植株上未开裂果荚内的种子进行无菌播种，所用培养基为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+8 g/L 琼脂+30g/L蔗糖+2 g/L活性炭。丛生芽的增殖与生根培养材料来源于无菌播种90 d的无根种胚苗。炼苗所用植物材料为生根培养90 d的组培苗。

1.2试验方法

1.2.1丛生芽的增殖与生根

以无菌播种90 d后，芽长为0.5～1.0 cm尚未生根的白花拟万代兰小苗为材料，采用 L9（34） 正交试验研究不同基本培养基、6-BA、IAA、椰子汁（新鲜椰子汁）对丛生芽增殖和生根的影响（表1）[8]。每瓶接种7株（图1-A），每个处理30瓶，3次重复。培养条件为：温度（25±2） ℃，相对湿度70%～80%，光照度1 000～1 500 lx，光照时间12 h/d。培养30 d后统计增殖数、生根数、叶片数，测量根长，并对每个处理中随机选择的10株植物进行生长状况评分，以1～4分计：1表示植株长势差， 增殖数

少，出现褐化；2表示长势整齐，但增殖数少或植株欠健壮；3表示长势整齐，植株根系健壮，茎叶生长良好；4表示长势整齐，植株健壮，新生芽多而饱满。根据统计分析结果，筛选适合白花拟万代兰丛生芽增殖和生根的最适培养基。

1.2.2炼苗移栽

将生根壮苗后的组培苗放置于人工气候箱中进行炼苗，培养条件为：温度（25±2） ℃，光照度1 000～1 500 lx，光照时间12 h/d。选择大小适合的组培苗，将其在人工气候箱中闭瓶培养10 d，开瓶培养1 d后[9]，从培养瓶中取出幼苗，用清水洗净培养基，再用1 000倍75%可湿性多菌灵溶液浸泡处理12 h，自来水冲洗后备用（图1-B）。以苔藓、泥炭土、珍珠岩、木屑4种基质为4个因素，每因素1、2、3 3个体积比例作为3个水平，采用L9（34）正交试验设计配置移栽基质研究其对白花拟万代兰组培苗移栽成活率的影响。移栽后置于温室中培养，温室环境条件为：温度（25±2） ℃，光照度1 000～1 500 lx，光照时间12 h/d，60 d后统计白花拟万代兰组培苗移栽成活率。

1.2.3数据处理方法

用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行方差分析和多重比较[10]；采用以下公式进行原球茎的增殖系数、生根率、平均根长、平均叶片数的计算。

增殖系数=增殖后芽数/接种外植体数[11]；

生根率=（生根植株总数/接种植株总数）×100%；

平均根长=所有植株总根长/总根数；

平均叶片数=植株叶片总数/总株数。

2结果与分析

2.1不同处理对丛生芽增殖的影响

丛生芽增殖试验结果表明，MS作为基本培养基，添加1.0 mg/L6-BA、0.2 mg/L IAA、250 mL/L椰子汁时，丛生芽的增殖系数达到最高水平，为3.57，且生长状况良好，植株大小整齐，植株根茎健壮，新生芽多（图1-C）。根据各因素R值大小可知，4种因素对增殖系数的影响强弱表现依次为基本培养基类型>椰子汁>IAA>6-BA（表2）。白花拟万代兰丛生芽增殖培养的最佳培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+250 mL/L椰子汁；最不理想培养配方为：KC+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+250 mL/L椰子汁。二者的差别在于基本培养基和激素浓度，MS基本培养基更有利于白花拟万代兰的增殖，适宜的激素浓度有利于白花拟万代兰的增殖，过高的激素浓度反而抑制白花拟万代兰的增殖。

不同处理对白花拟万代兰增殖系数的影响差异较大，6-BA对白花拟万代兰增殖系数的影响小。方差分析结果，培养基F值为24.902、椰子汁F值为14.016、IAAF值为12319，对白花拟万代兰丛生芽增殖的影响显著，6-BAF值为0.081，对丛生芽增殖的影响不显著（表3）。

2.2不同处理对丛生芽生根的影响

从表4可以看出，当椰子汁含量为50 mL/L、IAA 0.5～1.0 mg/L 时，生根数和根长均达到较高值，当IAA浓度低于0.5 mg/L时则不利于生根。通过比较Ra值可知，不同因素对白花拟万代兰丛生芽根长的影响主次关系依次为：椰子汁>基本培养基类型>6-BA>IAA。不同因素对白花拟万代兰丛生芽生根数量的影响主次关系依次为：IAA>基本培养基类型>椰子汁>6-BA。在基本培养基为VW，添加1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L IAA、50 mL/L椰子汁的培养基中，白花拟万代兰组培苗平均根长最长，为0.48 cm。当基本培养基为KC、6-BA质量浓度达到2.0 mg/L、IAA 质量浓度达到1.0 mg/L、椰子汁浓度达到250 mL/L时，平均生根数达最多，为2条（图1-D）。白花拟万代兰生根培养的最佳配方[JP3]处理为：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA+50 g/L椰子汁。

不同处理对白花拟万代兰丛生芽生根数量的影响差异较大，6-BA对白花拟万代兰丛生芽生根的影响最小。方差分析表明，椰子汁F值为16.397，对丛生芽根长的影响显著；IAA F值为13.138，对丛生芽生根的影响显著；6-BA F值为0.397，对丛生芽根长的影响不显著（表3）。椰子汁对白花拟万代兰丛生芽新生根系数量有一定的促进作用。

2.3不同处理对叶片数量的影响

根据各因素R值大小可知，4种因素对白花拟万代兰叶片数量的影响强弱依次表现为：基本培养基类型>椰子汁>IAA>6-BA。促进白花拟万代兰植株生长的最佳培养配方处理为：KC+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+50 mL/L椰子汁，其平均叶片数量最多，达3.92（表5）。方差分析结果，基本培养基类型F值为19.996对白拟万代兰长叶影响显著，椰子汁F值为8.341对白花拟万代兰长叶有一定的作用。

2.4不同基质配比对白花拟万代兰移栽成活率的影响

炼苗移栽的试验结果（表6）表明，白花拟万代兰组培苗移栽成活率达92%以上。其中5个试验组合成活率达100%

（图1-E、图1-F），所选用的基质对白花拟万代兰的栽培成活均表现出很好的效果，但在栽培试验过程中有一部分植株出现了烂根现象。根据各因素R值大小可知，4种因素对白花拟万代兰栽培成活率的影响强弱依次表现为泥炭土>木屑>苔藓>珍珠岩。

方差分析结果（表7）表明，泥炭土F值为12.255、木屑F值为11.278，对白花拟万代兰假植成活率的影响显著，苔藓F值为6.654、珍珠岩F值为0.150，对白花拟万代兰假植成活率的影响不显著。最优的基质体积配比为苔藓 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠岩 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

3结论与讨论

目前，国内还没有对白花拟万代兰的组培进行系统的研究，对拟万代兰属的相关研究也很少。本试验与常规的兰花组织培养相比，将增殖培养和生根培养同时进行，所筛选的培养基配方对白花拟万代兰增殖和生根均有较好的效果，从而缩短了白花拟万代兰成苗的时间。白花拟万代兰为附生兰，主要通过其特有的气生根，从空气中吸收水分和营养元素，或从根周围的残存物质中吸收水分和营养，为适应附生生活，减少水分损耗，它们一般都具有由茎的一部分膨大而形成的肉质假鳞茎，叶片革质[12]。附生兰科植物不仅对附生环境要求严格，而且多数生长缓慢，每个生长轴1年中仅产生1个芽，需要较长的时间才能进入成熟繁育期[13]。

基本培养基MS、1/2MS、VW、BS、KC及它们的改良型已经普遍应用于兰花的组织培养中[14]。在蝴蝶兰的组织培养中，相关学者认为，采用1/2MS基本培养基较适合蝴蝶兰的生长[15]。激素对诱导植株再生和增殖有显著的影响[16-17]，IAA能够钝化体细胞的形成，抑制体细胞胚的形成[18]，椰子汁含有多种营养和激素，经过高压灭菌后与兰花组培培养基的其他活性物质相容性高，能够刺激愈伤组织或者原球茎的形成，提高细小片段外植体的存活率，调整兰花花芽和类原球茎的分化过程[19]。本试验结果表明，基本培养基类型、IAA、椰子汁对白花拟万代兰丛生芽增殖的影响显著。试验筛选出适宜丛生芽增值的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L +椰子汁250 mL/L。

有机物和天然物质如椰子汁、土豆泥、香蕉匀浆等已经被普遍用于兰花组培中。在许多兰花品种的培养基中加入有机添加剂（如椰子汁、土豆泥、香蕉匀浆）对兰花生长增殖有促进作用[20]。本试验结果表明，椰子汁对丛生芽根长的影响显著，与李正民等对蝴蝶兰的研究结果[21]相似。试验筛选出适宜丛生芽生根培养的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+椰子汁50 g/L。

白花拟万代兰的根为肉质根，因而需要栽培基质透水性好，且具有一定保水保肥能力，容易进行灭菌处理，组培苗移栽还要根据兰花的品种选用适宜的植料[22]。栽培试验过程中出现一部分植株烂根现象，可能与栽培植料的持水性过高有关，与杨振华对蝴蝶兰栽培基质的研究[23]相似。试验结果表明，泥炭土、木屑对白花拟万代兰栽培成活率的影响显著，最优的基质体积配比为：苔藓 ∶[KG-*3]泥炭土 ∶[KG-*3]珍珠岩 ∶[KG-*3]木屑=1 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2 ∶[KG-*3]2。

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