防治烟草黑胫病的微胶囊药剂制备及持效期

董瑜++郭伟+++任浩++孔凡玉+++冯超

摘要：以密胺树脂为囊壁，采用原位聚合法将4种有效防治烟草黑胫病的杀菌剂制备成微胶囊，并测其相关性能表征，结果表明，各原药微胶囊包覆完好，致密，粒径大小适宜，分布均匀，高效液相色谱和红外分析显示，各原药微囊包覆率高且成分结构未发生改变。温室盆栽试验表明，15%甲霜灵微胶囊悬浮剂、60%甲霜灵微胶囊粉剂、60%烯酰吗啉微囊粉剂的防效高于常规药剂72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂，持效期长达35 d以上，在生产中有较好的应用前景。

关键词：杀菌剂；微胶囊；性能表征；盆栽；烟草黑胫病

中图分类号： S435.72文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0166-04

收稿日期：2015-01-07

基金项目：福建省南平市科技项目（编号：201203）。

作者简介：董瑜（1989—），男，山东济宁人，硕士，主要从事烟草病害防治研究。E-mail：dongyu915101089@163.com。

通信作者：孔凡玉，研究员，硕士生导师，主要从事植物病理学研究。Tel：（0532）88701526；E-mail：kongfanyu123@163.com。微胶囊技术是指将芯材（固体、液体或气体）包裹在囊壁材料中，形成直径几微米至几百微米微小容器（即微胶囊）的技术，与常规农药剂型相比，微胶囊制剂具有持效期长、农药有效利用率高、可减少或避免农药因外界环境造成的分解流失、降低农药对环境污染等特点[1-2]。烟草黑胫病是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，也是中国烟草的主要病害[3]，其病原为烟草疫霉，破坏性极强，大田侵染后常造成烟株成片凋萎死亡[4]。目前生产上防治烟草黑胫病仍以药剂防治为主。农业上常用的药剂有甲霜灵、烯酰吗啉、乙磷铝等，这类内吸性杀菌剂可通过植物疏导进入发病部位，抑制孢子囊、孢子萌发，从源头上控制菌丝体的形成生长。由中国农业大学理学院、中国农业科学院植物保护研究所联合开发的丙烯酰胺类杀菌剂丁吡吗啉是我国具有自主知识产权的创新农药品种，经温室及大田试验，丁吡吗啉能有效防治烟草黑胫病[5]。拜耳作物科学公司开发的氟吡菌胺是具有独特作用机理的新型苯甲酰胺类杀菌剂，主要用于防治卵菌病害如霜霉病、疫病等，主要作用于细胞膜上的类血影蛋白，使类血影蛋白发生移位表现杀菌活性，与目前常用药剂如甲霜灵、烯酰吗啉等作用机制不同，且无交互抗性[6-7]。但此类剂型的化学药剂存在高毒、持效期短、残留量大、易污染土壤及水源等通病，且目前关于防治烟草黑胫病的微胶囊杀菌剂研究尚未见报道。本试验对上述药剂进行微胶囊化，并测定其防治效果、持效期，有效解决杀菌剂使用过程中因其吸附性低、流动性强造成的残留污染、药效短等问题，并减缓植物抗药性的产生，旨在为杀菌剂类农药新剂型的开发及其在烟草病害防治上的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

烟草品种：小黄金1025（中国农业科学院烟草研究所）。供试菌株：烟草黑胫病菌（0号小种），保存于中国农业科学院烟草研究所。供试药剂：96%甲霜灵原药（扬州科林化学品有限公司），98.3%烯酰吗啉原药（扬州科林化学品有限公司），95%氟吡菌胺原药（广西南宁广酞农业化工有限公司），丁吡吗啉原药（质量分数≥99%，中国农业大学），72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂（江苏利民化工有限责任公司），50%烯酰吗啉可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司）。试剂：多种非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂复配物（农乳0203）、亚甲基双萘磺酸钠NNO，烷基萘磺酸盐甲醛tersperse 2425、370%～40.0% 甲醛、三聚氰胺、二甲苯、氯化铵、氢氧化钠、碳酸钠、盐酸、黄原胶、乙二醇等均为分析纯试剂；甲醇、乙腈为色谱纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。仪器：Agilent 1220 infinity LC高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；LC-10AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；PHS-3D功能型pH计（上海三信仪表厂）；DP-02型激光粒度分析仪（珠海欧美克仪器有限公司）；NIKON Eclipse E100双目显微镜（上海普赫光电科技有限公司）；85-2A型数显恒温测速磁力搅拌器、JJ-1精密增力电动搅拌器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；ZNHW型智能控温仪（上海腾方仪器设备有限公司）；Pulverisette 6 单罐行星式高能球磨机（上海人和科学仪器有限公司）；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜（株式会社日立制作所）；美国Nicolet-380型傅立叶变换红外光谱仪（KBr压片）（美国热电集团）。

1.2方法

1.2.1微胶囊的制备

1.2.1.1密胺树脂预聚体的制备过程按Yuan等的方法[8]制备密胺树脂预聚体。在锥形瓶中加入三聚氰胺和甲醛（摩尔比1 ∶2），用碳酸钠调节pH值到8.5～9.0，升温至70 ℃，密闭搅拌，反应10 min后获得密胺树脂预聚物水溶液。

1.2.1.2微胶囊水悬浮剂的制备在装有搅拌器的三口圆底烧瓶中加入甲霜灵原药（15.625 0 g）和二甲苯（27.0 g），磁力搅拌器搅拌均匀后加入2.5 g助剂0203，充分振荡形成稳定的O/W乳液，加入42.0 g密胺树脂预聚体，调节转速至400 r/min，2 h内加入稀盐酸缓慢调节pH值至4.2，后加入 2 g 氯化铵固化囊壁0.5 h，加入氢氧化钠调节pH值至6.5～7.0，加入2 g分散剂NNO，再加入0.2 g黄原胶、4 g乙二醇，用水将体系总质量补足至100 g，混合均匀即得到15%甲霜灵微胶囊缓释剂水悬浮剂。

1.2.1.3微胶囊粉剂的制备将甲霜灵、烯酰吗啉、丁吡吗啉、氟吡菌胺原药分别与水以质量比1 ∶2混合，加入1%分散剂2425，于球磨仪中进行研磨，至原药颗粒小于5 μm，在装有搅拌器的三口圆底烧瓶中加入原药 ∶密胺树脂预聚体（1 ∶1），调节转速至400 r/min，2 h内加入稀盐酸调节pH值至4.2，后加入2 g氯化铵固化囊壁0.5 h，加入氢氧化钠调节pH值至6.5～7.0，以5 000 r/min的转速离心晾干即得微胶囊粉剂。

1.2.2形态特征取制备的微胶囊加水稀释分散涂抹于载玻片上，自然晾干后，喷金处理，扫描电子显微镜下观察。

1.2.3粒径大小及分布用激光粒度分布仪测定微胶囊的粒径大小及分布。

1.2.4包覆率测定取3份微胶囊悬浮液各2.0 mL（微胶囊粉剂称取2.000 0 g），加入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，振荡1 min，过0.22 μm滤膜，在相应色谱条件下测定农药含量，即为囊外农药量，包覆率计算公式如下：

包覆率=（有效成分总投入量-囊外有效成分）/有效成分总投入量×100%。 （1）

各原药色谱条件如下：甲霜灵色谱条件：Agilent 1220 infinity LC高效液相色谱仪，SunfireTM C18 色谱柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量 10 μL，检测波长220 nm，流动相乙腈 ∶甲醇 ∶水=25 ∶35 ∶40（体积比），保留时间5.42 min。氟吡菌胺色谱条件：LC-10AT型高效液相色谱仪，ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长265 nm，流动相甲醇 ∶水=75 ∶25（体积比），保留时间约为4.6 min。烯酰吗啉色谱条件：LC-10AT型高效液相色谱仪，ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样定量环20 μL，检测波长 243 nm，流动相甲醇 ∶水=65 ∶35（体积比），经过滤（0.45 μm尼龙膜）、脱气处理。丁吡吗啉色谱条件：LC-10AT型高效液相色谱仪，OD-SC18色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm），流速：1.2 mL/min，柱温室温，进样量：10 μL，检测波长240 nm，流动相甲醇 ∶乙腈 ∶水=30 ∶30 ∶30（体积比）。

1.2.5红外分析将上述制备的微胶囊过滤，用蒸馏水冲洗、干燥获得甲霜灵微胶囊干粉。用红外分析仪分别测定各原药、微囊干粉、密胺树脂囊壁的红外吸收光谱。

1.2.6温室盆栽试验菌谷制备：500 g谷子加水1 L煮开至半数谷粒呈开花状，装入500 mL三角瓶，120 ℃灭菌 30 min。无菌条件下取1 cm×1 cm的烟草黑胫病菌菌块转接到含有菌谷的三角瓶内，28 ℃培养14 d备用。将烟苗移栽到直径10 cm、高10 cm的花盆中，用灭菌土壤、草炭与珍珠岩培养（体积比为=2 ∶2 ∶1）[9]，每盆1株。移栽缓苗后进行药剂处理。2～3 d后于根部接菌谷10 g/株。设A、B、C、D、E、F、G、H 8个处理：A（对照）：不施药剂，接菌谷；B：施72% 甲霜灵·锰锌可湿性粉剂600倍液；C：接菌谷，施50%烯酰吗啉可湿性粉剂1 200倍液；D：15%甲霜灵微胶囊水悬浮剂1 200倍液；E：60%甲霜灵微胶囊粉剂0.20 g；F：60%烯酰吗啉微胶囊粉剂0.34 g；G：60%丁吡吗啉微胶囊粉剂0.67 g；H：60%氟吡菌胺微胶囊粉剂0.06 g。A、B、C、D按倍数稀释后灌根50 mL/盆，微胶囊粉剂与一定量细土混匀，等量埋于烟株根际。每处理15盆，3次重复。将烟苗置于人工气候室内培养[10]（白天30 ℃，黑夜28 ℃，光照时间：12 h/d，相对湿度95%）。施药后7、14、21、28、35 d计算病情指数、防治效果。

病情指数=∑（各级病株数×级数）/（最高发病级数×调查总株数）×100；（2）

防效=[（对照组病指-处理组病指）]/对照组病指×100%。（3）

1.3数据分析

用DPS 13.0统计软件处理数据，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1形态特征

根据上述条件制备15%甲霜灵微胶囊悬浮剂（图1-a）及各粉剂（图1-b），电镜下观察，微囊悬浮剂形态良好，表面光滑致密无凹陷，大小均一，分散性能良好；微囊粉剂表面包覆完全、致密。

2.2粒度分布

采用激光粒度分布仪对其粒度分布进行研究，可知该微胶囊悬浮剂粒径主要分布在10～20 μm之间，平均粒径为12.93 μm（图2-a）；粉剂粒径主要分布在7～17 μm之间，平均粒径为9.76 μm（图2-b）。

2.3包覆率测定

经高效液相色谱分析各微胶囊剂包覆率见表1。

2.4红外分析

图3-A至图3-E分别为15%甲霜灵微胶囊悬浮液、60%甲霜灵微胶囊粉、60%烯酰吗啉微胶囊粉、60%丁吡吗啉微胶囊粉剂、60%氟吡菌胺微胶囊粉剂的红外光谱图，各图中a、b、c分别是原药、密胺树脂囊壁、微胶囊干粉的红外吸收光谱图。可以看出，各微胶囊的红外谱图（图3中谱线c）是原药物质（图3中谱线a）与密胺树脂囊壁空壳谱图（图3中谱线b）的叠加，即微胶囊的红外谱图中包含原药和囊壁的特征吸收峰，表明各原药被密胺树脂包覆且成分结构未发生改变。

2.5温室盆栽试验

盆栽试验结果见表2，接种黑胫病菌14 d后，各药剂都表现出较高的防效，微胶囊中防效最高的是15%甲霜灵微胶囊悬浮剂的92.1%，低于对照药剂（93.0%）。21 d后最高防效为82.3%，高于对照药剂（75.7%），直至35 d时最高防效（75.1%）仍高于对照药剂。甲霜灵微胶囊粉剂、烯酰吗啉微囊粉剂也表现出同样的防效趋势，14 d 50%烯酰吗啉可湿性粉剂防效为87.4%，比60%烯酰吗啉微囊粉剂（75.6%）高。35 d后50%烯酰吗啉可湿性粉剂防效只有58.0%，烯酰吗啉微囊粉剂防效略高（61.7%），60%甲霜灵微胶囊粉剂防效为69.1%。丁吡吗啉、氟吡菌胺的微囊粉剂虽然防效效果不好，但从21 d到35 d防效降低幅度较小，表现出了微囊持久缓慢释放的效应。由此可知，15%甲霜灵微胶囊悬浮剂、60%甲霜灵微胶囊粉剂、60%烯酰吗啉微囊粉剂28 d后防效高于72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂2种常规药剂，持效期长达35 d以上。

3结论与讨论

本研究选择了能有效防治烟草黑胫病的杀菌剂——甲霜灵、烯酰吗啉、丁吡吗啉、氟吡菌胺制备微胶囊，测定其相关性能表征，并以72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂作为对照研究其温室盆栽防效，结果表明，15%甲霜灵微胶囊悬浮剂、60%甲霜灵微胶囊粉剂、60%烯酰吗啉微囊粉剂的防效高于常规药剂72%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、50%烯酰吗啉可湿性粉剂，持效期长达35 d以上，体现微胶囊剂对常规剂型在缓释性及药效持久性方面具有优势，为杀菌剂类农药新剂型的开发和其在烟草病害防治上的应用奠定了基础。目前农药微胶囊的制备方法从囊壁形成原理上大致可分为物理法、化学法及物理化学法。其中化学法包括界面聚合法和原位聚合法[11-13]。由于原位聚合法包封率高、稳定性好，抗水渗透力强，成型稳定，综合成本较低，因而被广泛使用[14]。 本试验以三聚氰胺和甲醛经原位聚合反应生成的密胺树脂作为囊壁材料。杀菌剂经微囊化后其药效、持效期与微胶囊的释放机理密切相关，而微胶囊的释放性能受测定时的分散介质、芯壁比、温度、光照、微生物等多种因素影响[15]。囊壁经改性后也会影响囊壁的理化性质，进而改变包囊物的释放特性。如PEG接枝的微胶囊作壁材可以缓解初始突释效应[16]。用硅烷偶联剂KH550改性脲醛树脂后，经SEM观察发现，在形成的脲醛树脂微胶囊表面有一薄层[17]。季铵化的微胶囊衍生物在中性介质中的溶解度增加[18]。由于微胶囊囊壁上存在许多纳米级的微孔，在减少农药用量、延长持效期的同时，减少了农药施用次数，使农药残留、环境污染、抗药性等问题得到缓解，这些问题还有待于进一步深入研究。

参考文献：

[1]华乃震. 农药微胶囊剂的加工和进展（Ⅱ）[J]. 现代农药，2010，9（4）：6-10.

[2]高德霖. 微胶囊技术在农药剂型中的应用[J]. 精细化工基地信息通讯，2000，20（3）：11-15.

[3]马国胜，高智谋. 烟草黑胫病菌培养性状的研究[J]. 中国农业科学，2007，40（3）：512-517.

[4]马国胜，高智谋，陈娟. 烟草黑胫病菌研究进展（一）[J]. 烟草科技，2003，189（4）：35-42.

[5]慕长炜，袁会珠，李楠，等. 4-[3-（吡啶-4-基）-3-取代苯基丙烯酰]吗啉类化合物的合成及杀菌活性[J]. 高等学校化学学报，2007，28（10）：1902-1906.

[6]Valérie T，Fran ois B，Catherine S，et al. Novel tools to identify the mode of action of fungicides as exemplified with fluopicolide[J]. Recent Developments in Management of Plant Diseases，2009，1：19-36.

[7]Martins M R，Pereira P，Lima N，et al. Degradation of metalaxyl and folpet by filamentous fungi isolated from Portuguese （Alentejo） vineyard soils[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2013，65（1）：67-77.

[8]Yuan L，Liang G Z，Xie J Q，et al. Synthesis and characterization of microencapsulated dicyclopentadiene with melamine-formaldehyde resins[J]. Colloid and Polymer Science，2007，285（7）：781-791.

[9]Dai X Y，Su Y R，Wei W X，et al. Effects of top excision on the potassium accumulation and expression of potassium channel genes in tobacco[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60（1）：279-289.

[10]Cartwright D K，Spurr H W. Biological control of Phytophthora parasitica var. nicotianae on tobacco seedlings with non-pathogenic binucleate rhizoctonia fungi[J]. Soil Biology and Biochemistry，1998，30（14）：1879-1884.

[11]Morgan P W，Kwolek S L. Interfacial polycondensation.Ⅱ.Fundamentals of polymer formation at liquid interfaces[J]. Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry，1996，34（4）：531-559.

[12]Saihi D，Vroman I，Giraud S，et al. Microencapsulation of ammonium phosphate with a polyurethane shell. Part Ⅱ. Interfacial polymerization technique[J]. Reactive and Functional Polymers，2006，66（10）：1118-1125.[13]Yuan L，Liang G Z，Xie J Q，et al. Preparation and characterization of poly（urea-formaldehyde） microcapsules filled with epoxy resins[J]. Polymer，2006，47（15）：5338-5349.

[14]戴杜雁. 原位聚合制备微胶囊的方法及其应用[J]. 天津纺织工学院学报，1994，13（1）：95-101.

[15]Dong Z J，Ma Y，Hayat K，et al. Morphology and release profile of microcapsules encapsulating peppermint oil by complex coacervation[J]. Journal of Food Engineering，2011，104（3）：455-460.

[16]Bhattarai N，Ramay H R，Gunn J，et al. PEG-grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release[J]. Journal of Controlled Release，2005，103（3）：609-624.

[17]Li H Y，Wang R G，Hu H L，et al. Surface modification of self-healing poly（urea-formaldehyde） microcapsules using silane-coupling agent[J]. Applied Surface Science，2008，255（5）：1894-1900.

[18]Bayat A，Dorkoosh F A，Dehpour A R，et al. Nanoparticles of quaternized chitosan derivatives as a carrier for colon delivery of insulin：ex vivo and in vivo studies[J]. International Journal of Pharmaceutics，2008，356（1/2）：259-266.韩宝艳，纪明山，刘妍，等. 苦参抑菌活性成分的化学结构与作用机理[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：170-172.