维生素B6营养缺乏小鼠模型的构建及其对生长、血糖的影响

沈珊齐++钱炳俊+++索庚++吕颖芳++赵艳云

摘要：以维生素B6正常、缺乏、恢复、增强型食物饲喂小鼠，以血浆中维生素B6主要形式磷酸吡哆醛水平为评价指标，以小鼠体质量和血糖水平为考察因素，通过饮食营养缺乏构建获得维生素B6营养缺乏小鼠模型。结果表明，维生素B6营养缺乏小鼠血浆中磷酸吡哆醛未能检测，恢复组小鼠血浆中磷酸吡哆醛水平（215.67 pg/mL）得到较大的恢复，与对照组（157.00 pg/mL）之间没有显著性差异（P>0.05）；且维生素B6营养增强组小鼠血浆中磷酸吡哆醛水平（341.67 pg/mL）显著高于其他各组（P<0.05）；维生素B6营养缺乏4周后小鼠平均体质量（15.62 g）显著低于维生素B6正常小鼠（18.31 g），补充维生素B6后小鼠体质量迅速恢复；同时，缺乏期维生素B6营养缺乏小鼠的空腹血糖水平始终低于正常小鼠，补充维生素B6后其水平恢复缓慢。

关键词：维生素B6；缺乏模型；小鼠；生长；血糖

中图分类号：S852.21文献标志码：A文章编号：1002-1302（2016）02-0266-03

收稿日期：2014-10-13

基金项目：上海市自然科学基金（编号：11ZR1416200）。

作者简介：沈珊齐（1989—），女，湖北荆州人，硕士研究生，主要从事食品营养、保藏与加工研究。Tel：（021）34206613；E-mail：asd@sjtu.edu.cn。

通信作者：钱炳俊，博士，助理研究员，主要从事食品营养研究。Tel：（021）34206613；E-mail：bjqianfd@sjtu.edu.cn。维生素B6是一种水溶维生素，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆醛（pyridoxal，PL）和吡哆胺（pyridoxamine，PM ）3种形式，活化形式主要是5-磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate，PLP ）。它是维持人体生理功能必需的微量营养素，以辅酶形式参与糖、蛋白质和脂肪酸的正常代谢，并与白细胞、血红蛋白的合成相关。近年来研究还显示，维生素B6有一定的抗氧化能力，能够清除氧自由基[1]。在生活中，维生素B6的摄入常被忽视，维生素B6缺乏在中国人群中比较普遍，2012年深圳市居民膳食结构调查显示，人们对核黄素、硫胺素、维生素B6、叶酸和钙等微量元素摄入量偏低，其中维生素B6缺乏最为严重，仅为推荐摄入量的16%[2-3]。维生素B6缺乏虽然不会直接造成严重症状，但会导致虚弱、失眠、神经紊乱、唇干裂、舌炎、口腔炎、动脉硬化、贫血以及细胞介导免疫损坏等一系列容易被忽视的慢性健康问题。通常，维生素B6亦是糖代谢、氨基酸和DNA合成不可或缺的辅酶[4]，对人体生长发育具有重要的影响。因此，阐述维生素B6对人体免疫等生理功能的影响的分子机制，获得其营养缺乏型的小鼠模型尤为重要。本研究采用自建配方，手工烘焙加工维生素B6正常、缺乏、恢复、增强型小鼠饲料，通过4周的缺乏饲喂和4周的恢复饲喂试验，以血浆中维生素B6活化形式磷酸吡哆醛水平为评价指标，以小鼠体重和血糖水平为考察因素，通过饮食营养缺乏构建获得维生素B6营养缺乏小鼠模型，进一步丰富维生素B6在生理功能调节中作用的理论。

1材料与方法

1.1材料

正常雄性3周龄Blab/c小鼠28只购自上海史莱克动物中心。

1.2试剂

饲料中的蔗糖、盐、植物油等均为食品级，购自欧尚超市，纤维素购自阿拉丁（试剂）上海有限公司，维生素A、D、E、B1、B2、B6、B16购自上海信谊药业有限公司，烟酸和泛酸来自上海捷瑞生物技术有限公司，硒和微生素选用美国斯旺森公司保健品，矿质元素为相应化学纯试剂。强生稳豪型血糖试纸（ONETOUCH Ultra Test Strips）购自强生公司，标准品磷酸吡哆醛购自美国Sigma公司。

1.3方法

1.3.1试验设计将28只雄性3周龄BALB/c小鼠随机分为2组：缺乏组（21只）和对照组（7只）。分别采用维生素B6缺乏和正常的自制饲料饲喂4周。然后，将缺乏组随机再分为3组：缺乏组、恢复组和增强组，每组7只，分别采用维生素B6缺乏、正常、增强的自制饲料继续饲喂4周，对照组喂完全饲料，构建维生素B6缺乏小鼠模型。

1.3.2维生素B6缺乏饲料的配制参照Miller等试验配方[5-7]和国家标准GB 14924.3—2001《实验动物小鼠大鼠配合饲料》，在小鼠饲料基本营养构成的基础上，根据饲料成品的特性，对饲料中的成分比例进行调整，添加了淀粉，最终形成的配方见表1。

除维生素B6外，其他矿物质和维生素组成则参照国家标准GB 14924.3—2001《实验动物小鼠大鼠配合饲料》，具体见表2和表3。水溶性维生素片研磨成粉末后，溶解于水中；化学级矿物质试剂原料称量后溶解于水中。在蛋白、糖、油等组要成分按比例混合后，加入适当比例维生素水和矿物质水，加入适量脂溶性维生素，同时加入各组对应的维生素B6的量，补充一定水分，捏成面团，分割成直径1 cm的粗棒状或者长圆柱形的颗粒，微波加热，淀粉糊化后冷却成型，每日早上投喂。由于水溶性维生素加热易分解，在饮用水也按照相同配方添加水溶性维生素，定时定量补充。

小鼠饲养在上海交通大学实验动物中心完成，饲养环境条件为：光照/黑暗时间为12 h/12 h，温度（24±1） ℃，湿度（60±5）%。

1.3.3小鼠生长指标的测定小鼠饲养期间，每周四下午对所有小鼠进行称质量，比较不同组小鼠质量变化。

1.3.4小鼠血糖的测定小鼠饲养期间，每周五上午投喂饲料前，尾部取血，采用强生血糖仪（强生稳豪倍易型血糖仪）配合强生试纸测定空腹血糖。

1.3.5小鼠血浆磷酸吡哆醛水平分析饲喂8周后，参考Miduttun等对B族维生素的测定方法[8]，使用液相色谱串联质谱（LC/MS/MS）分析小鼠血浆中维生素B6活化形式磷酸吡哆醛含量。仪器采用上海交通大学分析测试中心的超高效液相色谱（ACQUITY UPLC system，MA，USA）串联三段四级质谱仪（AB SCIEX，Toronto，Ontario，Canada）。

采样：每组小鼠取3个平行，毛细管眼眶取血，冰上保存，1 h内2 000 g、4 ℃离心10 min，取上清。样品的前处理：60 μL 血样加入等体积三氯乙酸（TCA，60 g/L），冰上混合 1 h，5 800 g、4 ℃离心15 min。转移上清至新的EP管中，氮吹吹干后100 μL甲醇定容。

色谱条件如下，色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18。测定离子对：246.00/97.00。流动相：组分A，650 mmol/L 乙酸；组分B，100 mmol/L七氟丁酸溶解于流动相A；组分C，90%乙腈。流速，1.3 mL/min。标准品用甲醇溶解，配制100 ng/mL，半数稀释制作标准曲线。得到R2=0.997 5，0.304～100 ng/mL的检测限。

2结果与分析

2.1不同处理小鼠生长水平差异

由图1可见，饲养初期，各组小鼠体质量基本一致。饲养3周，缺乏组各组小鼠体质量都显著低于对照组小鼠（P<005），第4周继续保持该趋势。当恢复组和增强组小鼠恢复维生素B6补充后，小鼠体质量迅速增长，接近对照组水平。此时，缺乏组小组体质量仍然显著低于其他各组。维生素B6增强饲养2周后，增强组体质量高于恢复组，但差异不明显。最后2周，恢复组和增强组小鼠体质量基本没有差别，略低于对照。说明补充日常所需维生素B6即可以满足生长需求，迅速恢复生长水平。

2.2维生素B6缺乏对小鼠血糖的影响

由图2可见，试验初期，维生素B6缺乏组小鼠空腹血糖水平低于正常的对照组小鼠。第2周时，这种现象最为明显，对照组小鼠的空腹血糖水平显著高于其他各组小鼠。整个试验期，维生素B6缺乏小鼠的平均血糖水平都低于对照组。当缺乏小鼠开始补充维生素B6时1周（试验第5周），可以看到，其他各组小鼠平均空腹血糖水平仍低于对照组。但之后的6～8周，增强组小鼠空腹血糖水平始终略高于对照组，恢复组小鼠与对照组基本一致，只有缺乏组小鼠平均空腹血糖水平始终低于其他各组。可见，维生素B6对于机体维持空腹血糖水平有一定影响，缺乏后再补充可逐渐回复正常水平。

2.3维生素B6缺乏对血浆中PLP的影响

PLP是体内维生素B6水平的重要指标。图3结果显示，在维生素B6缺乏饮食小鼠中，PLP没有检测到。其他3组，PLP含量从大到小依次为增强组（341.67 pg/mL）>恢复组（215.67 pg/mL）>对照组（157.00 pg/mL），表明在4周的恢复期后，小鼠体内的维生素B6水平得到了很好的恢复，甚至是伴随大剂量增强得到提升。但是，10倍增强的饮食并未在PLP水平上体现出相应的放大倍数。同时，恢复组的小鼠血浆中PLP水平表现要优于对照组。结果表明维生素B6缺乏后，补充日常饮食建议维生素B6剂量即可。

3结论与讨论

由于维生素B6是碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢的重要辅酶，维生素B6对机体健康生长有重要影响。早在1945年，对维生素B6进行饲喂研究发现，维生素B6缺乏小鼠体质量会低于正常小鼠[5]。近期Doke等的研究也显示维生素B6缺乏会影响组织生长[6]。本试验也发现维生素B6缺乏小鼠体质量显著低于正常小鼠，这与Lewicka等研究认为补充维生素B6可以显著增加大鼠的体质量[9]类似。Huge等研究也发现缺乏维生素B6会导致大鼠的生长率比正常饮食低一半[10]，而本研究则进一步阐明，缺乏维生素B6导致的生长缓慢，是可以通过及时补充日常所需的维生素B6得到迅速改善的。

碳水化合物代谢在2种类型的糖尿病中都有重要影响。血糖主要由胰岛素调控。维生素B6的缺乏会导致胰腺和血循环中的胰岛素量减少[11]。空腹血糖的水平主要可以反映胰岛素对血糖的调节作用。空腹血糖量越低，表明胰岛素对血糖的调节能力减弱，胰岛素功能下降。维生素B6可能对血糖调节有影响。Solomon等研究表明补充吡哆醇可以降低链霉素引起的糖尿病动物的血糖水平[12]；在高血糖症的情况下，磷酸吡哆醛和总的维生素B6及其衍生物水平也会显著下降[13]；在机理上，Toyota等的研究则显示，维生素B6缺乏小鼠胰岛素B细胞的功能会退化[14]。可以看到在缺乏期，缺乏维生素B6的小鼠空腹血糖含量普遍低于对照组。维生素B6缺乏小鼠胰岛素调节能力下降。

维生素B6缺乏小鼠血液循环中磷酸吡哆醛缺失，体质量生长变缓，血糖调节能力下降，试验采取的饲料和饲养方法可以有效得到维生素B6缺乏小鼠模型。在维生素B6长期缺乏的情况下，继续缺乏、恢复维生素B6供应、10倍增强维生素B6可以补充每日饮食所需的维生素B6，就能逐渐恢复正常生长和提高血糖调节能力。

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