1种创新单孢子分离及霉菌生长形态观察方法

李贵正++刘纪臣+++李新柱++武磊

摘要：以淡紫拟青霉为例，介绍了1种简易的单孢子分离及霉菌生长形态观察方法。单孢子分离时，通过whatman滤纸过滤获得孢子悬液，使用玻璃点样毛细管点样于凹玻片凹槽中央，普通光学显微镜下观察获得单孢子；生长形态观察时，凹槽中分离的单孢子覆盖融化的固体培养基，经湿室培养后，单菌落用棉兰染色后观察，加盖盖玻片可用油镜观察。该方法能快速、准确分离到单孢子，并很容易观察不同生长期霉菌、放线菌的自然生长状态。

关键词：单孢子分离；霉菌形态；观察

中图分类号： S432.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0390-02

收稿日期：2015-03-11

基金项目：山东省工业提质增效升级专项基金[编号：鲁财企指（2014）61号]。

作者简介：李贵正（1976—），男，山东临沂人，硕士，工程师，主要从事微生物发酵研究。Tel：（0539）7198660；E-mail：liguizheng@kingenta.com。真菌、放线菌的纯培养经常需要获得单孢子，单孢子分离也是植物病理研究中的一项基本技术。单孢子分离的方法很多，目前常用方法有琼脂平板稀释纯化法、微量注射器分离法[1]、单孢直接挑取分离法[2]、连续变倍体视显微镜分离法[3]、实体解剖镜单孢分离法[4]、孢子震落水洋菜平板法[5]等，但这些方法操作繁琐，且需要一些不常见的精密仪器，如微量注射器、实体解剖镜、连续变倍体视显微镜等，制约了上述方法在普通实验室的应用。沈萍等的简易单孢子分离法，须要点样于培养皿内壁方格内，然后将皿盖小心、快速翻转，然后放于低倍镜下观察[6]，此方法工作量较大，且观察不方便。传统的霉菌、放线菌形态观察方法有直接制片观察法、载玻片培养观察法、插片法、玻璃纸观察法、琼脂槽培养法、仪器设备自动制片法等，这些方法只能观察到真菌、放线菌某阶段的形态特征，不能观察菌丝体的自然生长状态，且以上方法在获得菌丝显微特征的同时，均不能获得菌落层次上的形态特征[7]。本研究提出了1种简易的单孢子分离及霉菌生长形态观察方法，该方法操作简便易行，能很容易观察到菌落不同层次上的形态特征，且能随意观察不同生长期霉菌、放线菌的自然生长状态，以期为实验室单孢子分离和霉菌生长形态观察提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）购于中国农业微生物菌种保藏中心。

1.1.2培养基马铃薯琼脂培养基（原配方以无菌水进行 3 ∶1稀释，以调整其硬度和降低营养物浓度）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，补足蒸馏水至1 L。

1.1.3主要试剂和仪器“U”形玻璃棒，whatman 滤纸（孔径10 μm，英国），凹玻片，盖玻片，玻璃点样毛细管（长度100 mm；内径0.3 mm，华西医科大学），玻璃涂布器，直径9 cm 漏斗，乳酸石碳酸棉兰染色液，漩涡振荡器，擦镜纸（湿热灭菌后烘干备用），20% 灭菌甘油，0.05% Tween-80 无菌水，Nikon- ECLIPSE -50i 光学拍照显微镜（日本）。

1.2方法

1.2.1单孢子分离方法准备工作：用75%乙醇溶液擦拭漩涡振荡器、光学显微镜等，超净工作台内紫外杀菌30 min。拟青霉培养7 d，加5 mL无菌水于培养皿中，用涂布器刮下平板表面菌落。用孔径10 μm的 whatman 滤纸过滤 2 次得孢子悬液。加入95 mL 0.05% Tween-80无菌水和 20个直径5 mm的玻璃珠，放在漩涡振荡器充分振荡10 min[8]。孢子溶液用0.05% Tween-80无菌水梯度稀释至浓度约为10万～30万个/mL（血细胞计数板每大格约1 个孢子）。将毛细管放于三角瓶中，待液面升至毛细管3/4时，拿出轻轻点样于凹玻片的凹槽中央，然后加盖盖玻片。用低倍镜观察，只保留单孢子液滴的凹玻片，其余的用擦镜纸擦去后重新点样。

1.2.2单菌落获取和生长形态观察方法准备湿室：培养皿内铺1张圆形滤纸，然后放置 “U”形玻璃棒，棒上面放置1块凹玻片（凹面向上），盖上皿盖，外用纸包扎，121 ℃湿热灭菌30 min，然后置于100 ℃烘箱中烘干。冷却后每皿加入 5～7 mL 20%的灭菌甘油保湿。融化培养基：将试管中稀释好的PDA固体培养基加热融化后放于55 ℃水浴锅中保温、待用。覆盖培养基：吸取100 μL 55 ℃的培养基，迅速滴入已分离到单孢子的凹槽中，快速转动使其平整。培养：28 ℃恒温培养。观察：既定时间拿出，乳酸石碳酸棉兰染色液染色，光学显微镜下拍照观察，必要时可加盖玻片后用油镜观察。

2结果与分析

单孢子分离结果见图1。

单菌落获取结果见图2。

每隔一定时间从培养箱中拿出凹玻片，放于显微镜下拍照。图3：萌发的分生孢子；图4：分生孢子长出菌丝体；图5：形成密集的菌丝体；图6：菌落中心开始产生分生孢子；图7：

菌落边缘还未产生分生孢子；图8：菌落边缘产生大量分生孢子。

3结论和讨论

单纯自然形态观察时，可省去单孢子分离的步骤，毛细管点样后直接覆盖培养基即可；此法对产生孢子的放线菌同样适用；如孢子直径较小，应使用40倍的物镜观察分离；梯度稀释后，显微镜下如有多个孢子，可用灭菌的针或牙签挑去多余孢子；若没有whatman滤纸，可用4层擦镜纸替代。

本方法的创新之处：仅用凹玻片和常规的光学显微镜就能很容易分离到单孢子；不须要制备专门的毛细滴管，使用市售的玻璃点样毛细管即可；加盖盖玻片可有效防止液滴干燥，使操作时间延长到3 min以上；通过孔径10 μm的whatman滤纸过滤，可得纯净的孢子悬液，几乎无菌丝体残留；凹玻片的凹槽加入适量培养基不会外漏，且加入的培养基较薄，便于观察；用20%甘油保湿，效果明显优于水琼脂；能随时观察真菌、放线菌的自然生长状态。

该单孢子分离方法不需要特殊分离仪器，一般实验室均能采用，很易观察到不同生长期霉菌、放线菌不同层次上的自然生长状态，可在实验室中推广使用。

参考文献：

[1]高薇薇. 介绍一种简便的真菌单孢子分离方法[J]. 中国中药杂志，1992，17（3）：148.

[2]柴荣耀，金敏忠. 介绍一种单孢直接挑取获得单孢菌株的方法[J]. 植物保护，1991（5）：53.

[3]张书建，何月秋. 介绍一种简单的真菌单孢子分离法[J]. 云南农业大学学报，2003，18（3）：315-316.

[4]孙广宇，张天宇. 一种简易单孢子分离技术[J]. 植物检疫，1996，10（1）：40-41.

[5]姜开梅，范静华，朱有勇. 玉米大斑病的分离、培养和产孢方法的研究[J]. 云南农业大学学报，2004，19（3）：272-274.

[6]沈萍，范秀荣，李广武. 微生物学实验[M]. 北京：人民教育出版社，1980：72-74.

[7]孙建广，周欣，肖佳雷，等. 一种便于丝状真菌显微观察的培养方法[J]. 植物生理学报，2014，50（2）：229-232.

[8]汪军，杨腊英，毛超，等. 淡紫拟青霉E7菌株固体放大发酵产孢培养基和工艺条件研究[J]. 热带作物学报，2013，34（10）：2038-2045.朱灵峰，郝丹迪，耿悦，等. 硅藻土基多孔陶粒的制备及其对染料废水的吸附降解[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：392-394.