不同繁殖季节牦牛睾丸组织VEGF及其受体分布比较

陈国娟，袁莉刚，李聪，闫振龙

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070)



不同繁殖季节牦牛睾丸组织VEGF及其受体分布比较

陈国娟，袁莉刚，李聪，闫振龙

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】 探索VEGF及其受体(VEGFR2)在繁殖期和繁殖间期成年牦牛睾丸组织中的分布特点并进行比较分析.【方法】 应用免疫组织化学SP法检测VEGF及其受体(VEGFR2)分布特征并通过IPP图像分析软件进行定量统计.【结果】 免疫组织化学显示，成年牦牛睾丸中，VEGF表达于各级生精细胞以及Sertoli细胞和Leydig细胞，强表达于长形精子，小血管内皮细胞见强阳性表达，肌样细胞未见表达；其受体VEGFR2表达于各级生精细胞及Sertoli细胞，且Leydig细胞内强表达，小血管弱表达；性成熟牦牛睾丸组织中VEGF和 VEGFR2的表达繁殖期高于繁殖间期，但无显著统计学差异(P>0.05).【结论】 VEGF及其受体在性成熟牦牛睾丸组织中表达丰富，表明其参与精子发生及局部微环境的调节，不同繁殖期有一定的表达差异，提示其表达与牦牛发情活动密切相关.

关键词：牦牛；繁殖期；免疫组织化学；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体2

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的主要调节者；它们不仅在内皮细胞上有表达，在非内皮细胞上也有表达[1].研究表明，在人体内许多与生殖有关的细胞都有VEGF及其受体(VEGFR)的表达，是体内与生殖有关的重要生长因子之一[2].VEGF及其受体作为血管形成和生成的主要调节者，在哺乳动物的睾丸血管发生及微环境维持中有重要作用[3].Caires等[4]在牛睾丸中研究发现，VEGF维持生殖细胞存活和调节精子发生.研究报道，高原低氧诱导哺乳动物细胞VEGF表达量增加，VEGF特异作用于血管内皮细胞，使血管内皮细胞增殖，促进新生血管形成，改善微循环并增加血管的通透性，使高原动物生殖器官对低氧的适应能力显著加强[5].Wu等[6]对牦牛血管内皮生长因子基因的研究表明，血管内皮生长因子作为一种血管生成的关键调节器和一个内皮细胞的有丝分裂原，在高海拔适应性中起着重要作用.牦牛作为青藏高原的特产家畜，对高寒低氧环境具有极强的适应性.姚纪元[7]研究发现，VEGF基因表达随绒山羊毛囊周期性变化，且在生长旺盛期表达明显升高，具有一定的季节性表达规律.Wagener等[8]研究表明，VEGF在麆鹿繁殖期精子表达为高峰期，繁殖期结束开始回归.牦牛作为典型的季节繁殖动物[9]，VEGF及其受体在其睾丸的表达是否呈季节性变化，目前尚未见相关报道.鉴于此，本研究应用免疫组织化学SP法检测比较性成熟时的繁殖期及繁殖间期牦牛睾丸组织中VEGF及VEGFR2的分布特征并对其进行定量分析，探讨VEGF及其受体与睾丸生精功能和高原适应性之间的关系以及季节性表达的意义，进一步了解牦牛睾丸高原适应性的原理.

1材料与方法

1.1试验动物

牦牛睾丸样品采自青海省西宁市屠宰场，参照赵光前等[10]牦牛年龄门齿鉴别法，所采样品均为性成熟牦牛睾丸，分繁殖期(7～9月)5、7、8岁各两对，繁殖间期(1～2月)5岁3对，7岁和8岁各两对.以4%中性福尔马林溶液固定3 d后备用.

1.2试验试剂

VEGF兔抗鼠多克隆抗体(bs-1313R)和VEGFR2兔抗鼠多克隆抗体(bs-0565R)购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化染色试剂盒(sp-0023，由美国ZYMED公司生产)购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒(ZLI-9018和ZLI-9502)购自北京中杉金桥生物技术有限公司.

1.3切片制备

样品固定和切片制备：新鲜组织样品称质量测量，记录解剖数据，福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片(片厚 5 μm)，相邻切片3套分别用于VEGF和VEGFR2免疫组织化学SP法染色及阴性对照.

1.4免疫组织化学SP法检测VEGF和VEGFR2分布

免疫组织化学SP法进行染色；切片脱水、脱蜡后，进行高温高压抗原修复，后加一抗，一抗用VEGF和VEGFR2两种多克隆抗体均按1∶400比例稀释，阴性对照组用0.01 mol/L的PBS代替一抗(VEGF、VEGFR2)，4 ℃过夜，后孵育、清洗、显色、脱水、透明、封片.然后显微镜进行观察、照相.

1.5图像分析

光镜下观察免疫组织化学切片，每组切片中随机选取5张，在400倍显微镜(OlympusDP71)下进行拍照，每张切片采集5个视野，用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，测定阳性反应物的平均光密度，并用SPSS 21.0统计软件对数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示.

2结果与分析

2.1不同繁殖季节牦牛睾丸组织中VEGF及其受体的分布

VEGF与VEGFR2免疫组织化学阳性反应呈棕黄色，在不同繁殖季节性成熟(5、7、8岁)牦牛睾丸中均有表达.VEGF繁殖间期与繁殖期表达定位相同，主要定位于各级生精细胞(精原细胞、初级精母细胞、精子细胞及多种形态精子)、血管内皮细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞，肌样细胞未见表达(图1A-F)；其受体VEGFR2表达定位与VEGF相同，表达于繁殖间期与繁殖期性成熟牦牛睾丸各级生精细胞、Sertoli细胞、Leydig细胞强表达，血管弱表达(图1G-L)；两种因子均在精子变态期表达较强.

A-C：繁殖间期牦牛睾丸VEGF表达；D-F：繁殖期牦牛睾丸VEGF表达；G-I：繁殖间期牦牛睾丸VEGFR2表达；J-L：繁殖期牦牛睾丸VEGFR2表达。免疫组织化学染色，标尺示20 μm；CV：微血管；LC：Leydig细胞；ST：生精小管.图1　不同繁殖季节牦牛睾丸VEGF及其受体(VEGFR2)的表达Fig.1　The expresstion of VEGF in yak testis in different breeding season

2.2不同繁殖季节牦牛睾丸VEGF及其受体免疫组织化学检测比较

VEGF与VEGFR2在性成熟牦牛(5、7、8岁)睾丸免疫组织化学表达平均光密度统计结果表明，二者在睾丸表达定位基本相同，同一繁殖期与不同繁殖期睾丸内表达均无统计差异(P>0.05)，但繁殖期VEGF及其受体表达检测数值均略高于繁殖间期(表1-2、图2).

表1　高原牦牛睾丸VEGF及其受体VEGFR2平均

表2　不同繁殖季节牦牛睾丸VEGF及其受体

图2　不同繁殖季节VEGF及VEGFR2在高原牦牛睾丸中免疫组织化学表达的变化Fig.2　The immunohistochemistry expression of VEGF and VEGFR2 in yak testis in different breeding season

3讨论与结论

睾丸局部微环境受到各类细胞因子的调节，VEGF作为内皮细胞特异性强效有丝分裂原，被公认为是作用最强的血管通透因子，在体内VEGF只有通过与其受体相结合才能发挥生物学效应，VEGFR2是其最主要的受体之一，VEGFR2是血管生成和发育的主要调节者，它们不仅在内皮细胞上有表达，在非内皮细胞上也有表达[11].研究发现，VEGF及其受体在雄性生殖系统中通过刺激血管内皮细胞增殖，血管生成及其内皮细胞迁移，增加血管通透性等来调节睾丸功能[12].有关啮齿类动物睾丸的研究发现[13]，VEGF 表达量减小可抑制睾丸微血管的生成，进而影响睾丸微环境的调节.本研究发现牦牛睾丸中VEGF及其受体广泛表达于血管内皮细胞，提示VEGF可通过与VEGFR2相结合，作用于睾丸间质毛细血管，影响睾丸微环境循环，为生精细胞的增殖和分化创造条件.已有研究发现，缺氧时有机体局部氧化与抗氧化作用失衡，引起氧化应激，导致组织损伤[14].Verratti等[15]对不同年龄大鼠睾丸蔓状静脉丛的细胞氧化应激研究表明，高原环境中大鼠可能存在特殊的适应性机制，表现为对氧化应激反应降低.本研究牦牛睾丸中VEGF及其受体广泛表达于血管内皮细胞，结合VEGF及其受体的生理作用，提示VEGF及其受体在牦牛睾丸微血管系统高原适应性调节中发挥一定作用.

研究证实，VEGF及其受体能够维持牛睾丸生殖细胞的存活和调节精子的发生，对其生精过程也起着很重要的作用[4].Korpelainen等[16]曾报道VEGF转基因小鼠的生精细胞内有VEGF基因信号且出现于各级精子细胞.本研究发现牦牛睾丸中VEGF及其受体表达于各级生精细胞，提示其可能与精子发生密切相关，参与精子发生的整个过程；其在长形精子的强表达则表明VEGF可能参与精子变态过程.王训立等[17]研究雄性恒河猴性成熟的睾丸发现，生精小管内繁殖期较非繁殖期各级生精细胞丰富.研究报道，VEGF在麆鹿繁殖期精子表达为高峰期，繁殖期结束开始回归[8].刘辉等[18]研究报道，季节性繁殖动物生精功能在繁殖期出现高峰.牦牛为典型的季节繁殖动物，其繁殖季节为6～11月份[9].本研究中，性成熟期牦牛睾丸VEGF 及其受体在不同繁殖季节表达略有差异，呈现繁殖期略高于繁殖间期，提示VEGF及其受体对睾丸局部微环境的调节存在一定季节差异，这可能与牦牛进入繁殖期密切相关.

Ai等[19]在大鼠睾丸中的研究显示，VEGF同时表达于Sertoli细胞和Leydig细胞，Collin等[20]在人睾丸Sertoli细胞和Leydig细胞的研究亦有相同结果.刘辉等[18]研究绵羊睾丸显示，其Sertoli细胞和Leydig细胞呈现一定的季节性变化，表现为繁殖季节两种细胞形态和数量上均优于非繁殖季节.朱俊峰等[12]研究不同年龄段牦牛睾丸时发现，Leydig细胞在牦牛睾丸生精过程中发挥重要作用.本研究中VEGF及其受体同时表达于Sertoli细胞和Leydig细胞，且受体强表达于Leydig细胞，提示VEGF及其受体可能通过自分泌或旁分泌的形式，参与精子发生及局部微环境的调节，对Leydig细胞也有一定调节作用，在维持繁殖期睾丸功能的正常发挥中有着至关重要的地位.

综上所述，VEGF及其受体在性成熟牦牛睾丸组织中表达丰富，通过调节血管发生及其通透性，从而降低低氧对睾丸的影响，以自分泌或旁分泌形式参与精子发生及睾丸局部微环境调节，影响睾丸的功能，不同繁殖期存一定表达差异，这与牦牛发情活动密切相关.

参考文献

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(责任编辑赵晓倩)

Distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons

CHEN Guo-juan,YUAN Li-gang,Li Cong,YAN Zhen-long

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To explore and analyze the distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons.【Method】 This study used immunohistochemical SP technique to identify the distribution of VEGF and its receptor (VEGFR2) ,and IPP (Image-Pro Plus) statistics method was used to quantitative statistics.【Result】 Immunohistochemistry showed that VEGF was expressed in the spermatogenic cells,sertoli cells ,and leydig cells,and strongly expressed in the elongated sperma and vascular endothelial,no expressed in the muscle cells.VEGF' receptor (VEGFR2) was expressed in the spermatogenic cells and sertoli cells,strongly expressed in leydig cells.While weakly expressed in vessel weakly.The data showed that the average optical density of VEGF and VEGFR2 was higher in breeding season than non-breeding season in adult yak testis,but there was no significantly difference(P>0.05).【Conclusion】 VEGF and its receptors were expressed in abundance in adult yak testis,it showed that they participate in the spermatogenesis and regulate the local microenvironment.While there was certain difference in expression in different breeding season,it indicated that it closely related to the oestrous period in different seasons.

Key words：yak;breeding season;immunohistochemistry;VEGF;VEGFR2

通信作者：袁莉刚，女，教授，博士，主要研究方向为动物发育生物学.E-mail:yuan2918@126.com

基金项目：国家自然科学基金项目“牦牛睾丸高原适应性形态学研究”(31160488)；甘肃省自然科学研究基金“双峰驼隐睾神经递质分布及调控机理研究”(145RJZA223).

收稿日期：2015-03-03；修回日期：2015-04-23

中图分类号：S 852.16

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)01-0013-05

第一作者：陈国娟(1990-)，女，主要研究方向为动物发育生物学.E-mail:hopeissnow@163.com