葡萄脱毒及无毒苗木快速繁育技术

郭西智，顾红，陈锦永，张威远，张洋，程大伟（中国农业科学院郑州果树研究所/中国农业科学院果树生长发育与品质控制重点开放实验室，郑州 450009）



葡萄脱毒及无毒苗木快速繁育技术

郭西智，顾红，陈锦永，张威远，张洋，程大伟
（中国农业科学院郑州果树研究所/中国农业科学院果树生长发育与品质控制重点开放实验室，郑州 450009）

摘 要：葡萄病毒病被称为葡萄的“癌症”，在我国葡萄生产中普遍存在。目前，我国葡萄苗木繁育多采用枝条直接扦插方式，以农户分散经营为主，苗木市场比较混乱，易带来葡萄病毒积累和重复感染，对生产的危害日益严重。针对目前无病毒良种苗木繁育体系不健全，良种繁育场生产的良种苗木远远不能满足生产的需要，而选用无病毒苗木是防控葡萄病毒病发生的根本途径。本文详细介绍了葡萄无病毒原种的选择、葡萄病毒病的常用检测方法、带毒苗的主要脱除方法、以及无毒苗木的繁育体系及技术流程。

关键词：葡萄；病毒病；检测；脱毒；快繁

葡萄病毒病是世界性病害，凡是有葡萄栽培的地区都有病毒病存在。现已知侵染葡萄的病毒种类达60多种[1]，国内已报道过的葡萄病毒类病害有11 种[2]，其中扇叶病、卷叶病、栓皮病和斑点病等分布广、危害重[3]。葡萄被病毒浸染后，会造成减少产量、延迟成熟、降低含糖量、影响着色和风味，有的甚至使树势衰弱、落叶乃至死亡。研究表明，至少有10种病毒与葡萄卷叶病的产生有关。葡萄感染卷叶病毒后，植株生长衰弱，果穗、果粒变小且大小不均，着色不良，成熟期推迟，减产10%～76%[4]。

据统计，截止到2014年，我国葡萄栽培面积达到76.7 万 hm2，产量达1240万 t。葡萄病毒病的发生和流行对我国葡萄产业影响巨大，因此应引起高度重视。目前，葡萄繁殖方式主要靠扦插和嫁接，往往造成病株长期带毒并重复感染，表现为复合侵染和潜伏侵染的特征[1]。葡萄一旦被病毒侵染，将终生带毒，持久危害，没有药剂可以有效预防或控制，培育和使用无病毒苗木是防控葡萄病毒病的最根本有效的方法[5]。葡萄无病毒苗木根系发达，定植成活率高，长势旺，主干壮，节肥水；产量高，品质好；抗逆性强，病虫害少，可减少农药使用次数和使用量，降低生产成本，减轻环境污染[6]，经济效益和社会效益双丰收。因此，加强病毒检测和脱毒技术研究，繁育和栽培无病毒苗木具有重大意义。

1 葡萄无病毒原种选择

在5～10年生的葡萄园，选择生长健壮、性状优良、无病毒症状的植株作为繁殖材料。首先进行病毒检测，确定不带病毒后可作为原种登记并保存在防虫网室中，定期进行病毒病症状调查和病毒检测，无毒材料可用于繁育葡萄无病毒母本树，然后用于大量繁殖无毒苗木；如未发现无病毒单株，则必须进行脱毒处理。

2 葡萄病毒的脱除

葡萄脱除病毒的方法有多种，如热处理脱毒、茎尖培养脱毒、超低温脱毒、化学处理脱毒、体细胞胚胎发生脱毒及电疗法脱毒等，不同的方法各有优缺点。

2.1 热处理脱毒

根据病毒和葡萄组织细胞对高温耐受程度的差异，采用适当的温度和恰当的处理时间，使葡萄植株体内的病毒活性降低甚至失活，而葡萄植株细胞则快速生长，最终导致葡萄植株生长点附近的细胞不含病毒，从而达到脱毒的目的[7]。操作要点是：将待处理的优良品种或砧木移植到营养钵中，待长出3～5片叶时，放入恒温38 ℃的光照培养箱中处理2～3个月，然后切取1.5～2.0 cm的嫩梢，嫁接在盆栽无毒砧木上，成活后移植田间正常管理[5]，病毒待检。该方法设备简单、易操作，但存在成活率低、脱毒不完全的缺点。

2.2 茎尖培养脱毒

葡萄植株一旦染病就全身带毒，但在不同的组织和部位病毒的浓度分布有很大差异，一般生长点附近即茎尖和根尖的分生组织大多不含病毒或含量很低[1]。通过对茎尖的组织培养可达到葡萄脱毒、优良品种快速繁育和工厂化育苗的目的。操作要点：在春季切取待处理的优良品种或砧木的嫩芽0.1～0.2 mm，清洗消毒后，接种在辅加1.5～2.0 mg/L BA和20 g/L蔗糖的MS培养基上[7]，28 ℃恒温光照培养，经分化增殖后再经生根和土壤培养可繁育出无毒植株。茎尖培养成活率较高，但不能达到百分之百脱毒，脱毒率为94.7%[8]。

2.3 热处理与茎尖培养结合脱毒

综合葡萄品种及病毒种类等因素，在优良品种快速繁育和工厂化育苗过程中，适宜采用热处理和茎尖组织培养相结合的方法进行脱毒，该方法的最大优点是脱毒率高，可达100%，是比较理想的脱除葡萄病毒的有效途径，可以实现两种方法的脱毒效果互补，这说明该方法适用于葡萄病毒的脱除，有利于无病毒原种母本树的培育。其缺点是苗木成活率低，仅30.5%[8]。操作要点：将预先选好的优良单株或砧木的盆栽苗放入25～28 ℃下促其抽枝快长，待新梢长出3～5片叶时，放入光照4000～6000 Lx，相对湿度60%～80%，温度37～40 ℃的培养箱内处理2～3个月；切取1～2 cm长带芽嫩梢，10%次氯酸钠消毒10 min，75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗后在解剖镜下进行茎尖剥离，茎尖剥离大小为2～3 mm；将剥离的茎尖接种到茎尖培养基上，在恒温28 ℃下光照培养，待芽增大生长后，再转入生茎培养基上培养，促进丛生芽生长，以后再转入生根培养基上培养，促进生根[7-8]；经练苗、沙培、基质土培养成苗，检测无毒即可移栽至原种圃大量繁殖应用。不同功能培养基见表1。

表1　不同功能培养基配方[8]

2.4 超低温脱毒方法——玻璃化法[9-11]

研究发现，经超低温保存处理后再生的植物材料，其含毒量降低，大部分材料完全没有病毒，因此产生了低温疗法。在超低温条件下，植物体细胞内的新陈代谢和生命活动几乎完全停止，但细胞活力得以保存，遗传性状不会改变。超低温冰冻基于玻璃化理论。无论是脱除植物病毒还是植物材料保存，玻璃化法简单、快速、有效，是目前最常用的脱毒方法。

2.4.1 预培养

将剥取的葡萄茎尖在含0.3～0.4 mol/L蔗糖的培养基上培养1 d。预培养的目的是使材料脱水、增加含糖量和提高细胞膜在严重脱水条件下的稳定性。

2.4.2 装载处理

预培养后的茎尖放入2 mL的冷冻管中，然后用移液器吸入装载溶液（2 mol/L甘油 + 0.4 mol/L蔗糖），完全浸没茎尖，室温下处理20～30 min。

2.4.3 玻璃化溶液处理脱水

为保证超低温保存后材料能够成活，脱毒材料必须经过玻璃化溶液的处理，常用的玻璃化溶液为PVS2溶液：30%甘油(w/v)+15 % 乙二醇+15 % DMSO(w/v)+0.4 mol/L蔗糖的MS培养基，pH为5.8。将冷冻管中的装载溶液吸出，吸入1～2 mL的玻璃化溶液，5 min后，更换新鲜的玻璃化溶液，在0 ℃下处理30 min左右。

2.4.4 快速冷冻

将装有玻璃化溶液和茎尖的冷冻管迅速放入液氮中，冷冻1 h以上。

2.4.5 温水水浴

将冷冻管从液氮中取出，迅速放入40 ℃水浴锅中水浴2～3 min。

2.4.6 玻璃化卸载

水浴后，将冷冻管中的玻璃化溶液吸出，吸入装载溶液（MS液体培养基+2 mol/L甘油+1.2 mol/L蔗糖），室温下处理10～15 min，重复3次，以清除细胞内的玻璃化溶液。

2.4.7 后培养

将茎尖转到装有生长培养基的培养皿上培养1 d，再将茎尖转到新配制的生长培养基上进行培养。即可达到脱除病毒的目的。

2.5 其它脱毒方法

（1）化学药剂处理脱毒。研究发现，一些化学药剂具有延迟或抑制病毒复制的作用，其原理是影响病毒酶的合成。具体应用时通常是将化学处理与茎尖培养相结合进行病毒的脱除，这种方法取材要求不严，接种茎尖可大于1 mm，易于分化出苗，可提高存活率[12]。

（2）体细胞胚胎发生脱毒。在适宜的条件下，通过植物离体培养的细胞、组织、器官可产生类似胚胎的结构，进而发育成完整的植株。近年来该方法在葡萄病毒的脱除中得到应用，已成功脱除了多种韧皮部限制性病毒和线虫多面体病毒，在葡萄类病毒脱除研究中也表现出较高的脱除效率[1]。

（3）电疗法脱毒。电脉冲可以促进植株生长，获得无病毒植株。据报道，将3 cm长的葡萄茎段在30 mA的电流下处理15 min，可成功脱除葡萄病毒A[1]。

3 葡萄病毒的检测

经以上脱毒方法处理、培育出的植株，并非百分之百地脱除了病毒，只有一部分不带病毒，这就需要对所有植株进行病毒检测。目前采用的检测方法主要有5种：症状识别法、电镜观察法、指示植物法、血清学检测法、分子生物学检测法等。

3.1 症状识别法

受病毒侵染的葡萄，大部分表现出一定的症状，该症状是识别葡萄病毒病的重要依据，具有很高的诊断价值，许多葡萄病毒病可以通过症状初步确定[5]。如葡萄受卷叶病毒侵染后表现为：病株长势减弱；夏末秋初，植株下部叶片向下反卷，后逐渐蔓延至整个植株；红色品种叶脉间变红，白色品种叶色变黄；果穗小且果粒着色不良，成熟期延迟；根系发育不良，易受冻害；枝蔓嫁接成活率显著降低；生根能力差等。对葡萄生长期进行长期系统的观察可以获得良好的诊断效果。

3.2 电镜观察法

上世纪50年代，电镜技术就广泛应用到生命科学技术研究领域[13]，其观测结果直观、准确，还可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段之一[14]。在生产实践中，虽然有电镜检测新技术支持，但由于电镜设备昂贵，操作技术水平要求高，因此该法没有得到广泛应用。

3.3 指示植物法

其原理是通过汁液摩擦接种方式将待检测病害植株的汁液接种到对一种或几种病毒病敏感，并能表现出特殊症状的指示植物上的检测方法。运用指示植物法鉴定植物病毒病具有鉴定谱广、无需贵重仪器和设备、操作技术简便、易于掌握、结果直观性好等特点，因此在葡萄病毒检测过程中应用最多的方法即为指示植物法，也是最可靠的方法。其缺点就是耗时较长，时效性差，易受周围环境影响[13]，所以病毒检测时应注意隔离。葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用指示植物法进行检测[15]。

3.4 血清学检测法

血清学检测法中常用的是酶联免疫法（ELISA），该法是利用抗原抗体体外特异性免疫性反应检测葡萄病毒。血清学检测法检测葡萄病毒病具有快速、直观、方便及灵敏度高等特点，其结果的准确性往往依赖于抗血清的品质，且无法检测类病毒和不稳定的病毒[14]。葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒1、葡萄卷叶病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用酶联免疫法进行检测[15]。

3.5 以分子生物学为基础的RT-PCR检测法

RT-PCR检测技术是上世纪90年代发展起来的一种检测植物RNA病毒的方法，适用于多数植物病毒的诊断和检测。其原理是先把RNA反转录成cDNA，进而进行PCR扩增和杂交试验[16]。该法以其操作较简单，且具有高效、快速、灵敏度高、结果可靠等优点，因而具有广阔的发展前景，将来有望取代指示植物法检测葡萄病毒，尤其适用于检测那些耗时较长的韧皮部限制性病毒。葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒均可采用RTPCR法进行检测[15]。

4 葡萄无毒苗木的繁育

4.1 强化葡萄无毒苗木繁育体系建设

建立无病毒检疫检验制度及规范的操作规程。培育无病毒原种，防止苗木带毒传播，必须有相应的技术人员做保障。从事葡萄无毒苗木生产必须具备有育苗温室、用于原种保存的防虫网室、良种母本园、葡萄良种采穗园、葡萄种苗繁育圃等。

4.2 无毒苗木繁育技术

4.2.1 无毒试管苗繁育技术

图1　葡萄无毒苗木繁育流程

目前，葡萄大规模工业化育苗技术已逐渐成熟和完善，可广泛应用于葡萄无毒苗木的快速繁育。试管苗出瓶前需在阳光下进行炼苗，先带瓶盖练苗3～4 d，再打开瓶盖练苗2～3 d，当苗叶色深绿、根褐色老熟时即可出瓶沙培移栽，然后定植于母本园进行管理[4]，沙培基质配比为河沙:珍珠岩:草炭土=1:1:1。应该注意的是无毒苗快速繁育的各个环节必须严格按照操作规程操作，以防病毒侵染。

4.2.2 无毒苗木的扦插、嫁接

从母本园或采穗圃采取无毒枝条直接扦插、嫁接，达到快速繁育的目的。

4.3 快速繁育葡萄无毒苗木的工艺

快速繁育葡萄无毒种木工艺流程见图1。

4.4 防虫网室、无毒母本园及无毒苗繁殖圃的建立

防虫网室应建在通风透光良好、未见传毒线虫、6～8年之内没有栽植过葡萄的地块，与商品葡萄园和苗圃的距离大于50 m，网室建好后应全方位消毒。

葡萄无病毒母本园或采穗园应建在水肥良好、未见传毒线虫、6年之内没有栽植过葡萄的地块，与商品葡萄园和苗圃的距离大于50 m，以防止粉蚧等媒介从带毒葡萄园中传带病毒。

葡萄无毒苗繁殖圃建园时，应选择水肥良好、3年以上未栽植过葡萄的地块，园址应离其它葡萄园20 m以上。

建园前对土壤进行消毒。葡萄生长季按规定进行病毒抽检，发现病毒植株立即挖除淘汰，并将所有根系清除，同时对穴坑周围土壤进行消毒。各园区生产用农机具、修剪工具等专管专用，定期消毒。

4.5 葡萄无病毒苗木的质量要求及标准

葡萄无病毒苗木必须品种纯正、生长健壮，不带《全国农业植物检疫性有害生物名单》（农业部公告第617号，2006年3月）规定的有害生物。标准依据中华人民共和国农业部2010年颁布实施的标准（《葡萄无病毒母本树和苗木》NY/T1843-2010）执行。

参考文献

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作者简介：郭西智，男，助理研究员，主要从事果树和西瓜甜瓜栽培技术推广工作，E-mail:guoxizhi569@163.com

基金项目：陕西省科技统筹创新工程（2013KTDZ02-01）；河南省大宗水果产业体系资助。

收稿日期：2015-09-23

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.01.007