成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

施光正　马丽娟　赵海军

(浙江医学高等专科学校，浙江　杭州　310053)



成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

施光正马丽娟赵海军1

(浙江医学高等专科学校，浙江杭州310053)

〔摘要〕目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏，为心脏先循环灌流无钙台氏液，后循环灌流酶液，酶解完成后取左心室，迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎，吹打数次后离心，去上清，温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min，梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%，复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状，横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞，能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。

〔关键词〕心肌细胞； 急性分离； Langendorff灌流

能够得到高活性的心肌细胞是心肌细胞培养和电生理研究的基础，随着酶解法的不断完善与创新，酶解法成为获取成年大鼠心肌细胞的主要方式，但迄今为止尚未有完全统一的分离方法，本文主要阐述笔者的实验方法。

1材料及方法

1.1材料Wistar雄性大鼠20只，220~250 g，由上海斯特莱动物责任有限公司提供(动物许可证号SCXK〔沪〕2012-0002)。

1.2主要试剂Ⅱ型胶原酶(C6885)、XⅣ型蛋白酶(P5147)、BSA(A1933)、Taurine(T0625-100G)、G-Lutamic acid(G8415)NaH2PO4、KOH Sigma公司NaCl、KCl、Glucose、KH2PO4、MgCl2国产分析纯HEPES、EGTA BIOSHARP。

1.3主要实验仪器恒温水浴槽：JKI-MP-501A；超纯水：MILLI-Q；倒置镜：LeicaDMI3000B；Langendorff：自制灌流装置。

1.4溶液配方无钙台式液:HEPES 15 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaCl 135 mmol/L、KCl 4 mmol/L、NaH2PO41 mmol/L、Glucose 10 mmol/L(NaOH调整溶液pH值为7.4)，KB液： L-Glutamic acid 50.3 mmol/L、KCl 39.97 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、Taurine 19.98 mmol/L、MgCl23 mmol/L、KOH 80 mmol/L、EGTA 0.53 mmol/L、HEPES 10.7 mmol/L、Glucose 10.09 mmol/L(KOH调整溶液pH值为7.4)，酶液:0.16%蛋白酶、0.1%胶原酶、0.5 mg/ml胎牛血清(BSA，溶于无钙台氏液)

1.5实验步骤

1.5.1实验准备利用恒温水浴槽、蛇形玻璃罐、60 ml注射器、普通输液管道及调控开关搭建Langendorff灌流装置，如图1。……