连续缝合间断打结吻合动脉在小鼠心脏移植中的应用

崔得利　谭长军　刘　忠

(1大连医科大学附属第一医院普外科　大连　116011;2复旦大学附属中山医院肝癌研究所-上海市器官移植重点实验室　上海　200032)



连续缝合间断打结吻合动脉在小鼠心脏移植中的应用

崔得利1▲谭长军2▲刘忠1△

(1大连医科大学附属第一医院普外科大连116011;2复旦大学附属中山医院肝癌研究所-上海市器官移植重点实验室上海200032)

【摘要】目的应用连续缝合间断打结法吻合动脉建立小鼠心脏移植模型。方法近交系C57BL/6j( (H-2b))、BALB/c( (H-2d))小鼠各30只,建立小鼠腹部心脏移植模型 (C57BL/6j→BALB/c),连续缝合间断打结法端侧吻合供体升主动脉和受体腹主动脉;一针后壁先缝法连续吻合供体肺动脉和受体下腔静脉。观察移植心脏搏动持续时间及受体生存时间。结果手术成功率90%(27/30),总手术时间 (91.77±6.70)min,动脉吻合时间 (24.63±1.67)min,静脉吻合时间 (15.17±1.80)min。供心中位存活时间8 天,病理组织学示典型排斥反应。结论应用连续缝合间断打结法吻合动脉降低了小鼠心脏移植的手术难度,效果可靠,值得推广。

【关键词】小鼠;动物模型;心脏移植;动脉吻合

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81373874,81472218).

小鼠心脏移植模型是移植免疫学研究的重要工具[1],但建模要求高,动脉吻合是其中的难点[2],对于不具备显微外科基础的医学生而言难度较大。受器官缺血时间限制,器官移植动物模型多采用连续缝合法重建血流。但我们在前期训练中发现:应用经典的连续缝合法建立主动脉和腹主动脉端侧吻合,开放血流后,大出血和吻合口狭窄发生率较高,是建模失败的首要原因。有鉴于此,我们尝试应用连续缝合间断打结法改进动脉吻合,效果满意,报告如下。

材 料 和 方 法

实验动物选择SPF级近交系雄性小鼠,C57BL/6j(H-2b)为供体(n=30),BALB/c(H-2d)为受体(n=30),体质量22～25 g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。于无菌通风25℃恒温环境中饲养,术前不禁食、不禁水。

器械及试剂16倍手术显微镜 (上海医疗器械股份有限公司光学仪器厂),显微镊、显微持针器、显微剪 (上海金钟医疗器械厂),手术剪 (上海医疗器械股份有限公司),11-0、8-0、5-0带线缝合针(上海浦东金环公司),戊巴比妥钠(美国Sigma公司,用生理盐水稀释成1%),肝素钠注射液 (上海第一生化药业有限公司,用生理盐水配成50 IU/mL)。

手术方法

术前准备参考Corry等[3]的手术方法,建立小鼠腹部心脏移植模型。先受体后供体依次进行麻醉,均使用戊巴比妥钠0.005 mL/g腹腔注射麻醉,并联合乙醚辅助。

受体手术腹正中线剪开腹壁进腹,显露腹主动脉及下腔静脉。11-0线结扎睾丸动脉,8-0线集束结扎下腔静脉属支血管。在肾静脉下方及髂血管分叉上方各穿1根5-0阻断线,不打结,备用。

供体手术显露下腔静脉,从下腔静脉注入冰肝素盐水2 mL,完成供体肝素化。下腔静脉放血后迅速剪开胸腔暴露心脏,冰盐水纱布覆盖心脏5-0线结扎上、下腔静脉。离断主动脉及肺动脉,集束结扎其余血管,剪取心脏放入冰盐水中保存。

心脏移植阻断线打活结阻断腹主动脉及下腔静脉。11-0缝合针穿过腹主动脉前壁,悬吊血管壁,弯显微剪刀沿缝合针剪一椭圆形切口,同法在下腔静脉开窗。从冰肝素盐水中取出供心,置于受体腹部右侧,冰盐水纱布覆盖。11-0线将供体升主动脉两端分别与受体腹主动脉开口两端 (12点及6点处)缝合,作为两侧锚定线。11-0线连续缝合腹主动脉左侧壁至对侧锚定线,共4针,缝合过程预留“线圈”,周长约1.3 cm,一侧血管壁缝合结束后,从中间剪断“线圈”,相应的线头与线尾打结,打结时切忌上提血管以免误入气泡(图1)。

A:Two opposing anchor sutures placed 180° apart;B:Running suture using open loop;C:The loop was cut in between;D:Suture was tied individually as interrupted method.

图1连续缝合间断打结法示意图

Fig 1Schematic diagram of continuous-interrupted method

翻转供心至对侧,同法缝合动脉右侧壁,缝合结束前肝素盐水冲洗管腔,尽量剪短残余尾线,以免影响静脉左侧壁吻合。静脉吻合采用一针后壁先缝法[4]连续缝合肺动脉与下腔静脉。吻合完毕后,开放血流,温生理盐水复温,待复跳规则后复位肠管并关腹(图2)。

术后处理与观察术后25 w白炽灯照射15～30 min。每天观察小鼠的活动情况并通过触诊判断供心搏动情况,受体存活3天以上且心脏持续搏动则视为手术成功。术后未用抗生素及免疫抑制剂,术后第7天随机取5只小鼠的移植心脏行病理组织学检查,重点观察心肌组织损伤及炎性细胞浸润情况,依据2005年国际心肺移植协会(ISHLT)制定的心脏移植排斥反应标准[5]进行分级。

结果

心脏移植结果30例小鼠心脏移植手术的成功率为90%。总手术时间 (91.77±6.70) min,其中动脉吻合时间 (24.63±1.67) min,静脉吻合时 间 (15.17±1.80) min。3例手术失败,其中1例因麻醉意外死亡，2例因心脏流出道受阻,术后2 天内死亡,未出现心脏灌注不足或动脉狭窄等情况。供心中位存活时间为8天,供心停跳后,受体可长期生存。

A:Anastomosis was completed;B:After unclamping;C:Anastomotic sites of aorta and inferior vena cava;D:View before abdominal closure.

图2吻合完毕示意图

Fig 2Soheme of completed anastomosis

病理组织学检查供心存在不同程度的炎性细胞浸润,伴有心肌组织损伤,呈典型排斥反应,ISHLT分级为2R级(图3)。

A and B:The myocardial area appeared inflammatory cells infiltration,accompanied by myocardial tissue damage in rejection combination after 7 days following surgery (A:100×,B:200×);C and D:The myocardial area was intact in naive C57BL/6j heart (C:100×,D:200×).

图3心肌部位HE染色

Fig 3HE staining of mycardia

讨论

由于器官移植受缺血时间的限制,小鼠心脏移植的动脉吻合多采用连续缝合法,其主要优点是操作简便、快速。但我们在前期训练中发现如下缺点:(1) 腹主动脉开窗口径在端侧吻合中难以控制[6]。如腹主动脉开窗口与供体的升主动脉完全匹配,在缝合两端的锚定线后,两侧的血管边缘紧贴在一起,造成血管腔难以显露,尤其在最后1～2针时。若吻合口不匹配,在十分狭小的视野内连续缝合针距调整十分困难。(2) 血管吻合的空间和视野问题。在16倍显微镜下,若每次缝针后均拉紧缝线,则最后1～2针经常难以确定吻合血管边缘的空隙。如果采用降落伞法,一侧血管壁缝合结束后一起拉紧缝线,受腹主动脉外膜影响,常导致缝线无法拉紧甚至断线。(3) 连续缝合易导致吻合口狭窄、血栓等不良反应[7],成为制约建模成功的主要原因。

Sapountzis等[8]首先报道在显微外科血管吻合中使用连续缝合间断打结的方法,操作要点是:在缝合两端的锚定线后,从一侧开始连续缝合血管壁,但不拉紧缝线,而是留出较长的线圈,达到对侧锚定线后,中间剪断线圈,各自线圈的头尾线分别打结。我们将此法应用于小鼠心脏移植动脉吻合(图4)。

A:Running suture using open loop with the length of about 1.3 cm;B:The loop was cut,and suture was tied individually as interrupted method.

图4建立缝合线圈

Fig 4Establishment and cut of loop

在应用过程中,我们发现本法的主要优点是:(1) 两侧血管壁都是在充分显露血管腔的条件下进行缝合,最后缝线再分别打结,因此视野清晰,这对小鼠心脏移植的动脉吻合有着重要的意义。(2) 本法解决了吻合血管不匹配的难题。由于最后所有的缝线分别打结,打结时调整缝线偏向就可以纠正偏差。(3)单纯间断缝合法是显微血管吻合的“金标准”。相对于小静脉吻合,动脉血管壁顺应性差、弹性大,更加适用间断缝[9],但这又与器官移植的缺血时限相矛盾。连续缝合间断打结法解决了这一矛盾，相对于间断缝合,本法连续运针,节省了中间剪线和换针的时间。常规间断缝合法通常先固定两端,再缝中点,后提中点线,缝合最后2针时经常显露不佳,而应用本法,最后2针缝合时管腔显露清楚,缝合更确切。吻合后供受体血管匹配良好,未出现连续缝合后由于匹配不良引起的吻合口大出血 (图5)。

A:The left side of aort a was completed;B:The right side of aort a was completed, and the end of sutures must be cut as short as possible to avoid interference of venous anastomosis;C:Anastomoses of aorta and inferior vena cava were completed.

图5吻合口处血管匹配良好

Fig 5Good matching of anastomosic vessels

本法的不足之处在于:(1)剪断“线圈”后线尾易纠结在一起,打结拉线时可能会发生错误,将临近的缝线拉出。(2) 腹主动脉右侧壁缝合后残余的线尾可能会干扰下腔静脉左侧壁的缝合,操作过程中应加以注意。综上所述,连续缝合间断打结是建立小鼠腹部心脏移植模型的良好动脉吻合方式,简单易学,值得推广。

致谢复旦大学附属中山医院麻醉科何义舟主治医师指导手术操作。

参考文献

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The continuous-interrupted method for arterial anastomosis in mouse heart transplantation

CUI De-li1▲, TAN Chang-jun2▲, LIU Zhong1△

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,LiaoningProvince,China;2LiverCancerInstitute,ZhongshanHospital,FudanUniversity-Shanghai

KeyLaboratoryofOrganTransplantation,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the feasibility of continuous-interrupted method for arterial anastomoses in mouse model of heart transplantation.MethodsHeterotopic heart transplantations were performed from inbred C57BL/6j( (H-2b)) mouse (n=30) to BALB/c( (H-2d)) mouse (n=30),in which the graft′s ascending aorta was anastomosed end-to-side to the recipient′s aorta by continuous-interrupted sutures,and the pulmonary artery was anastomosed end-to-side to the inferior vena cava by continuous one-suture anastomosis.The survival time of grafts and the duration of cardiac impulse were observed.ResultsThe successful rate of transplantation was 90% (27/30).Total operation time was (91.77±6.70) min with,arterial anastomosis time of (24.63±1.67) min and venous anastomosis time of (15.17±1.80) min.Median beating time of donor heart was 8 days with acute rejection reaction indicated by pathological histology.ConclusionsThe technical difficulties of arterial anastomosis were reduced greatly by continuous-interrupted method, and we recommended this method for mouse heterotopic cardiac transplantation.

【Key words】mouse;animal model;heart transplantation;arterial anastomosis

(收稿日期:2015-06-24;编辑:段佳)

【中图分类号】R654.2

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.015

国家自然科学基金面上项目(81373874,81472218)

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:liuzhong69@sohu.com