小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

赵春燕+晏国洪+姜山

摘要： 苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶（CAD）催化木质素单体合成的最后一步反应，Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术，以小立碗藓基因组DNA为模板，使用Primer 5-Cracked设计的引物，扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒，经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌，筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证，得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182，即得CAD11-pTN182-CAD12，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体，并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用，可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除，验证小立碗藓CAD1基因功能，进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。

关键词： 小立碗藓；CAD1基因；基因克隆；载体构建；酶切

中图分类号： Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0059-05

苔藓植物是高等植物的低等类群，是陆生植物登陆早期的代表，含有一整套合成木质素的基因[1]，具备合成木质素的生理基础，但是苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。小立碗藓（Physcomitrella patens）隶属葫芦藓目葫芦藓科（Funariaceae）小立碗藓属（Physcomitrium）。小立碗藓生活史中单倍体的配子体时期占优势，其整个基因序列已知，核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，这使得基因敲除成为可能，并且试验过程中得到的突变体即为纯合体，为基因功能的研究提供了良好的材料[2]，已经成为植物分子生物学研究的模式生物。……