人参锈腐病生防用解淀粉芽孢杆菌Y—S—Y12菌株发酵条件的优化

屈俊廷+金海强+沈国娟+杨超博+李熙英

摘要： 研究了解淀粉芽孢杆菌Y-S-Y12菌株液体最佳发酵条件，旨在为提高其活性次级代谢产物的产量提供技术支持。通过不同培养条件、营养条件、单因素试验和均匀设计试验，对该菌株的最适发酵条件进行了优化，结果发现，Y-S-Y12菌株的最佳发酵时间为3 d，最佳发酵温度为28～33 ℃，最佳转速为150 r/min，最佳装液量为125 mL（培养容器的容量为250 mL），最佳初始pH值为6，供试培养基中Y-S-Y12菌株在NA培养基中的发酵效果最佳。Y-S-Y12菌株最优配方为1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氢二钾、24.86 g牛肉膏。

关键词： 解淀粉芽孢杆菌；抑菌率；均匀设计；发酵条件优化；人参锈腐病

中图分类号： S435.675 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）03-0158-03

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）广泛分布在自然界中，如植物体内、植物根际、土壤、深海水中均有分布。它们与枯草芽孢杆菌亲缘性很高，可以产生对多种真菌与细菌具有抑制作用的多种代谢产物。因为解淀粉芽孢杆菌存在广泛、易分离、易培养，能抑制植物病害，非致病，安全使用对普通人畜群体无害，而且不污染环境，因而特别受重视[1-5]。将解淀粉芽孢杆菌制成生物制剂，植物花部、枝干、叶、根部都可使用，施用方法可以采取对农作物拌种、灌根、喷施等，可广泛应用于作物采收前后的病害防治上，也有研究指出可应用于粮食果蔬储存保鲜上[6]。因此，解淀粉芽孢杆菌在植物病害生物防治方面具有广阔的应用前景。

Y-S-Y12菌株是金海强等[7-8]从杨树枝条中分离出来的拮抗菌株。结合形态学、培养特征及分子生物学方法鉴定Y-S-Y12菌株为解淀粉芽孢杆菌，是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，该菌在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物，对植物病原菌具有强烈抑制作用[3，9]。经过田间防病试验和室内抑菌试验，Y-S-Y12菌株对人参锈腐病（Cylindrocarpon destructans）的抑制作用最强，同时还有促进人参生长作用。另外，Y-S-Y12发酵浓缩液对人参锈腐病菌也具有较强的抑制活性。有关Y-S-Y12菌株发酵条件优化方面未见报道。对此，进行Y-S-Y12菌株发酵条件的优化试验，以期为Y-S-Y12菌株的扩大培养以及规模化生产菌剂打下基础。

1 材料与方法：

1.1 供试菌和培养基

供试菌为人参锈腐病菌和Y-S-Y12菌株，均由延边大学植物病理实验室保存。

供试培养基为NA培养基、PDA培养基、KB培养液、LB培养液，NA培养液，PDA培养液、基础发酵培养基[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及种子菌的制备 将Y-S-Y12菌株转接在NA培养基中，在25 ℃培养箱中培养48 h后取2环接种在NA培养液中，放入恒温30.6 ℃，转速为120 r/min摇床中振荡培养48 h，得到种子菌。

1.2.2 发酵浓缩液 将不同培养条件的发酵液用 4 000 r/min 离心机分离20 min，再过滤，将滤液浓缩到10%，灭菌待用。

1.2.3 不同培养条件对Y-S-Y12菌株发酵的影响 以温度为30.6 ℃，种子菌的接种量为1%，转速120 r/min，培养48 h为基本条件。在基础条件不变的情况下，不同培养时间（1、2、3、4、5、6、7 d），不同培养温度（23、28、33、38、43、48、53 ℃），不同转速（70、90、110、130、150、170、190 r/min），不同装液量（在250 mL的三角瓶中加入培养基量为50、75、100、125、150、175、200 mL），不同的起始pH值（4、5、6、7、8、9、10）及不同培养基（LB、NA、KB、PDA），测定发酵液在580 nm处的吸光值及发酵浓缩液对人参锈腐病菌的抑菌率，根据不同处理的菌体生长量和抑菌活性的大小确定最佳发酵条件。

抑菌活性测定采用双层培养基打孔法。先在PDA平板中间放入直径8 mm的人参锈腐病菌的菌碟1片，在菌碟两边1.5 cm处将第2层培养基打孔放置滴200 μL发酵浓缩液（2边对称），以只放置人参锈腐病菌菌碟的为对照，每个处理重复3个培养皿，放入20 ℃恒温箱培养6 d，测人参锈腐病菌菌落直径，计算抑菌率。

[JZ]抑菌率=[SX（]对照病菌菌落宽度-处理病菌菌落宽度 对照病菌菌落宽度-接种时菌碟宽度[SX）]×100%。

1.2.4 不同碳源对Y-S-Y12菌株发酵的影响 在基础发酵培养基中氮源含量和其他培养条件不变的情况下[11-13]，分别用蔗糖、柠檬酸钠、乙酸钠、乳糖、麦芽糖、淀粉等量替换基础发酵培养基中的葡萄糖，以基础发酵培养基作对照，测定不同碳源的发酵无菌液对人参锈腐病菌抑菌活性的影响，抑菌活性大小和菌量测定方法同“1.2.3”节。

1.2.4 不同氮源对Y-S-Y12菌株发酵的影响 在基础发酵培养基中碳源含量和其他培养条件不变的情况下，分别用牛肉膏、硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、尿素等量替换基础发酵培养基中的胰蛋白胨，以基础发酵培养基作对照，测定不同氮源的发酵无菌液对人参锈腐病菌抑菌活性的影响，抑菌活性大小和菌量测定方法同“1.2.3”节。

1.2.5 无机盐对发酵液抑菌活性的影响 在基础发酵培养基中碳源含量、氮源含量和其他培养条件不变的情况下，用硫酸镁、硫酸铁、硫酸锌、磷酸二氢钾等量替换培养基中的碳酸钙，以基础发酵培养基作对照，测定不同无机盐对人参锈腐病菌抑菌活性的影响，抑菌活性大小和菌量测定方法同“1.2.3”节。

1.2.6 均匀设计试验 在确定主要碳、氮源的基础上，对葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、磷酸氢二钾进行单因子试验，采用不同浓度梯度（葡萄糖0～2 g，依次增加0.4 g；酵母粉0～0.1 g，依次增加0.02 g；磷酸氢二钾0.1～0.2 g，依次增加0.02 g；牛肉膏1.5～2.5 g，依次增加0.2 g）。本研究采用DPS 7.05数据处理软件进行统计分析，在以上试验的基础上选择均匀设计法[14-15] U46的均匀设计表，用均匀设计使用表设计方案进行了多水平试验，并结合偏最小二乘回归分析[16]对其营养条件进行了优化。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对Y-S-Y12菌株发酵的影响

2.1.1 不同培养时间对Y-S-Y12菌株发酵的影响 随着培养天数的增加，D值和抑菌率均有增加的趋势，其中培养 3 d 时D值和抑菌率达到了高峰，随后D值和抑菌率均有下降趋势（表1）。结果表明，Y-S-Y12菌株的最佳发酵时间为3 d。

2.1.2 不同温度处理对Y-S-Y12菌株发酵的影响 随着温度的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趋势。当培养温度为28 ℃时D值最高，其次为33 ℃时的D值；培养温度为33 ℃时的抑菌率最高，其次为28 ℃时的抑菌率。之后随着温度的增高D值和抑菌率均有下降的趋势（表2）。结果表明，Y-S-Y12菌株的最佳发酵温度为28～33 ℃。

2.1.3 不同转速处理对Y-S-Y12菌株发酵的影响 随着转速的增加，Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率均有增加的趋势。当转速为150 r/min时D值和抑菌率达到了高峰 （表3）。结果表明，Y-S-Y12菌株最佳发酵转速为 150 r/min。

2.1.4 不同装液量处理对Y-S-Y12菌株发酵浓缩液的影响 随着装液量的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趋势。当装液量为125 mL时D值和抑菌率达到了高峰，其次是100 mL的D值和抑菌率（表4）。结果表明，Y-S-Y12 菌株最佳发酵装液量为125 mL。

2.1.5 不同pH值处理对Y-S-Y12菌株发酵的影响 随着pH值的增加，Y-S-Y12的D值和抑菌率均有增加的趋势。当pH值=6时D值和抑菌率达到了高峰，之后随着pH值的增加D值和抑菌率有下降趋势（表5）。结果表明，Y-S-Y12 菌株最佳发酵pH值为6。

2.1.6 不同培养基处理对Y-S-Y12菌株发酵的影响 在NA培养基上Y-S-Y12菌株的D值和抑菌率最高，其次为KB培养基和LB培养基上的D值和抑菌率（表6）。结果表明，Y-S-Y12菌株在NA培养基上发酵较好。

2.2 不同营养条件对Y-S-Y12菌株发酵的影响

不同碳源对Y-S-Y12菌株发酵的影响较大。其中以葡萄糖为碳源时的D值和抑菌率最高，其次为蔗糖，再次为麦芽糖（表7）。结果表明，Y-S-Y12菌株最佳发酵碳源为葡萄糖。

不同氮源对Y-S-Y12菌株发酵的影响较大。其中以牛肉膏为氮源时的D值和抑菌率最高，其次为胰蛋白胨，再次为硝酸钠（表8）。结果表明，Y-S-Y12菌株最佳发酵氮源为牛肉膏。

不同无机盐对Y-S-Y12菌株发酵的影响较大。其中磷酸氢二钾为无机盐时的D值和抑菌率最高，其次为硫酸镁和硫酸铁，再次为碳酸钙（表9）。结果表明，Y-S-Y12菌株最佳发酵无机盐为磷酸氢二钾。

2.3 碳、氮源单因素试验和均匀设计法优化

均匀设计方案及试验结果见表10。采用偏最小二乘回归[CM（25]法对试验结果进行回归建模分析，得到如下二次多项式回

3 结论

Y-S-Y12菌株的单因素培养条件优化结果表明，培养时间为 3 d，培养温度为28～33 ℃，转速为150 r/min，装液量为 125 mL（培养容器的容量为250 mL），初始pH值为6时的发酵效果最好；供试培养基中Y-S-Y12菌株在NA培养基中的发酵效果最佳。

通过不同碳源、氮源及无机盐对Y-S-Y12菌株发酵的影响研究，以葡萄糖为碳源，牛肉膏为氮源，磷酸氢二钾为无机盐时的发酵效果最好。进一步使用均匀设计法寻找最佳培养基配方，结果表明，最优配方为1.20 g葡萄糖、3.10 g酵母粉、2.00 g磷酸氢二钾、24.86 g牛肉膏，此时抑菌率为51.10%。

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