漆酶的形态特性表征及固定化研究

张安龙, 郗文君, 杜　飞, 周丹妮, 杨　楠

(陕西科技大学 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室, 陕西 西安　710021)



漆酶的形态特性表征及固定化研究

张安龙, 郗文君, 杜飞, 周丹妮, 杨楠

(陕西科技大学 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室, 陕西 西安710021)

摘要：使用固定化漆酶进行造纸废水深度处理可显著减少水中残留木素含量，运用SEM、XRD、激光粒度、能谱等分析手段，可提供一种关于漆酶固定化效果的有效评价方法.漆酶分子粒径主要集中在11.482～19.953 μm，海藻酸钠法及环氧化PVA法对漆酶的固定方式分别为内部包埋和表面吸附.在海藻酸钠包埋法中，固定的酶分子粒径大、数量多、固定牢固而不易脱落；环氧化PVA趋向于吸附小粒径的漆酶分子、易受环境影响，固定效果差.在相同活力下，海藻酸钠固定化漆酶结晶度高于PVA吸附法.硫、钠元素的定性，证实了漆酶的固定化效果.

关键词：木质素； 固定化漆酶； SEM； XRD; 形态分析

0引言

制浆造纸企业采用一级沉降、二级生化处理对造纸废水进行处理，在一定程度上可降低废水的污染负荷[1].《制浆造纸工业水污染物排放标准》(GB 3544-2008)规定CODcr排放值应低于80 mg/L[2].这样一来，二级出水不仅不能达到排放标准(如表1、表2)，并且由于木素降解引入的酚类及芳香族化合物亦难以降解.

研究表明，漆酶在处理含有大量木素降解产物的废水处理方面作用显著[3]，可去除造纸废水中的木质素衍生物以及漂白过程中产生的氯酚类物质[4].然而，游离酶存活时间短且难以回收利用，其固定化技术是实现漆酶连续使用和改善其稳定性的有效手段[5].使用常规出水指标评价漆酶的固定程度及活性受干扰因素较多，准确度差.目前，鲜有从形态学角度直观地对固定化漆酶进行观测和表征.

本实验分别采用吸附法和包埋法[6]进行漆酶的固定化处理，并使用SEM、XRD、粒径、能谱分析等分析手段对固定化漆酶进行了研究，这为生物酶的表征提供了参照和依据.

表1　造纸废水处理过程中的水质变化

表2　造纸废水污染物的降解变化

1实验部分

1.1主要材料

游离漆酶，Ruiubio公司(10 U/mg)；聚乙烯醇(PVA)；戊二醛(25%)；氢氧化钠；盐酸；海藻酸钠；无水氯化钙；乙酸；二甲基亚砜；环氧氯丙烷；愈创木酚；丁二酸；丙酮；乙酸钠；氯化钠；二氧六环；三氯乙烷；乙醇；乙醚；石油醚；五氧化二磷.以上药品均为分析纯.

1.2主要仪器

上海佑科紫外可见分光光度计(UV 6000型)；水浴恒温振荡器；台式酸度计；激光粒度分析仪(APA2000型)；场发射扫描电镜(日本理学S4800型)；X射线衍射仪(D/max-2200pc型).

1.3固定方法

1.3.1环氧化PVA吸附法[7]

(1)环氧化PVA的制备

配置质量分数为10%的PVA水溶液，称取100 g PVA 水溶液，加入35 mL、体积分数为25%的戊二醛，混合均匀，用HCl调节PVA水溶液pH 值为1～2，20 ℃下搅拌均匀，呈凝胶状后将其放入60 ℃水浴中反应3 h.

反应结束后，将块状凝胶打碎成颗粒状，粒状PVA 经丙酮洗、水洗，过滤后称取10.0 g PVA颗粒，加入10.0 mL 环氧氯丙烷和10. 0 mL 二甲基亚砜溶剂，以NaOH 为催化剂，控制反应pH 值为11～12，经反应一定时间后用HCl滴定至中性，再用丙酮与清水洗净后得到固定化载体环氧化PVA.

(2)漆酶的固定化

称取5 g环氧化PVA 载体，加入5 mL液态漆酶和10 mL pH=4.5的HAc-NaAc缓冲溶液，于35 ℃水浴中以150 r/min 转速振荡一定时间后获得固定化漆酶，用缓冲溶液洗涤至洗出液中无酶蛋白，并于4 ℃下保存.

1.3.2海藻酸钠包埋法

将20 mL菌丝悬浮液加入150 mL浓度为3%的海藻酸钠溶液并搅拌均匀，然后用注射器将混合液注入4%的CaCl2溶液中，立即形成光滑的小球.小球硬化一段时间后，用生理盐水冲洗，于4 ℃下保存.

1.4固定化漆酶酶活的测定

底物的配置：将137.4μL愈创木酚和4.5 g丁二酸加入800 mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节pH值至4.5，用蒸馏水定容至1 L.

取四支干净的试管，分别标明序号A、B、C、D.试管中均加入4 mL底物，其中试管A加入1 g环氧化PVA固定化漆酶，试管B加入1 g未固定的环氧化PVA；试管C加入1 g包埋法固定化漆酶，试管D加入1 g未固定的海藻酸钠小球.

混合均匀后于30 ℃水浴反应30 min，测定其在波长465 nm下的吸光度(OD465)值.试管A、C分别对照B、D管中加1 g未固定化漆酶的载体和4 mL底物.

酶活计算公式如式(1)所示，定义1 min 内转化1μmol 底物所需的固定化漆酶量为1个漆酶活力单位(U/g)[8]:

(1)

式(1)中:ε465(愈创木酚)=1.21×104L/(mol·cm);Δt为酶反应时间，min;ΔOD为吸光度的变化值;V为比色皿中溶液的总体积，mL;m为参加反应的固定化漆酶的质量，g;N为酶液稀释倍数;L为比色皿光径，cm.

1.5木质素浓度的测定[9]

由于木质素的紫外吸收光谱在280 nm处有特征吸收峰，因此，可以在波长280 nm下定量地测定木质素的含量(浓度).

木质素的提取方法如图1所示.

图1　废水中木质素的提取方法

2结果与讨论

2.1造纸废水深度处理效果

如表3所示，使用游离漆酶、海藻酸钠固定化漆酶及环氧化PVA固定化漆酶等深度处理造纸废水，均取得了一定的效果，其CODcr、色度均有所降低，并且木质素浓度在深度处理后也有所降低.其中，海藻酸钠固定化漆酶的处理效果最好，从处理前的120 mg·L-1降低至28 mg·L-1，这符合色度去除规律.废水中所含酚类、脂肪芳烃类等发色助色基团可能是造成造纸废水色度的主要原因.此外，使用漆酶处理造纸废水，其可生化性均有所提高，有助于造纸废水的处理.

表3　漆酶深度处理造纸废水的水质变化

2.2酶活

表4列出了两种不同载体固定化漆酶的酶活测定结果.漆酶原液酶活为100U/mg，无论是环氧化PVA载体还是海藻酸钠载体，两种不同的固定方法均取得了一定的效果.

但相比之下，海藻酸钠包埋法的固定化效果更好，这是因为环氧化PVA的固定作用是通过吸附，作用的漆酶应该停留在PVA固体颗粒的表面，而海藻酸钠固定化漆酶应该包覆在颗粒内部，海藻酸钠结构中连接着很多羟基和羧基，能够与多种离子发生吸附反应，所以常用其来包埋固定化酶或细胞[10,11].下文形貌分析验证了这一猜想.

另外，环氧化PVA固定化漆酶载体对漆酶的物理吸附作用存在缺点，酶和载体结合力容易受溶液中的pH、盐的浓度、温度等影响而减弱.因此,反应条件的变动易使酶从载体上脱落下来而失活，固定化酶可重复利用率低[12].

表4　固定化漆酶的固定率

2.3粒径分析

采用粒径分析仪对漆酶分子进行粒度分析，其结果如图2所示.游离漆酶分子粒径大小在5.754～34.674μm之间，其中主要集中分布在11.482～19.953μm，占总体的70.44%；粒径在11.482μm以下的酶分子比重占总体的14.28%；粒径在19.953μm以上的酶分子比重占总体的15.26%.

图2　游离漆酶分子粒径分布

2.4固定化漆酶的形貌分析

采用场发射扫描电镜对固定化漆酶与空白载体进行了观测.图3显示出游离漆酶分子表面光滑，呈不规则球状.图4(a)显示出海藻酸钠包埋法固定化漆酶，可以清晰地看到表面光滑的不规则球形物质，与图3中的游离漆酶酶分子相似，且主要分布在海藻酸钠载体内部，经固定化的漆酶在冷冻干燥后在海藻酸钠表面形成凸起；与之对比的是图4(b)显示出未经固定的海藻酸钠载体表面无明显的球状凸起，表面较平滑.由此说明，经海藻酸钠包埋法固定化漆酶被包埋在了海藻酸钠的内部.

图3　游离漆酶(×500)

(a)固定化漆酶　　　　　(b)空白载体图4　海藻酸钠固定化漆酶(×500)

图5～6为环氧化PVA固定化漆酶的对比图，其放大倍数分别为500倍和3 000倍.在图5(a)中，经环氧化PVA吸附法固定化漆酶表面粗糙、多见凸起层状结构，与之对比的图5(b)中环氧化PVA载体表面平滑、未见表面附着物，由此说明经环氧化PVA吸附法固定化处理的游离酶分子已吸附在环氧化PVA载体表面，达到了固定化的目的，但在此放大倍数下未能清晰地看到漆酶分子.

图6对环氧化PVA空白载体及固定化漆酶进行了3 000倍观测，从图6(a)中可以观测到环氧化PVA表面附着的光滑球状漆酶分子，结合漆酶粒径分析可知，经PVA吸附法固定化处理的游离漆酶吸附固定在PVA载体表面上的多为微小粒径的游离漆酶.

(a)固定化漆酶　　　　　(b)空白载体图5　环氧化PVA吸附法固定化漆酶(×500)

(a)固定化漆酶　　　　　(b)空白载体图6　环氧化PVA吸附法固定化漆酶(×3 000)

本形貌分析直观地展示了载体对漆酶的固定化作用，展示了在两种固定化方法中漆酶与载体的结合方式以及不同的作用粒径.实验表明，海藻酸钠可对较大分子漆酶进行内部包埋，而环氧化PVA则对小分子漆酶进行表面吸附.

2.5固定化漆酶的XRD分析

由图7可知，游离漆酶的XRD在2θ为15.8 °、18.2 °、19.5 °、20、5 °、22.3 °、23.1 °、30.5 °等处均出现一个较尖锐的衍射峰，结晶度为45.57%；环氧化PVA固定化漆酶出现吸收峰的位置随漆酶浓度的改变变化很小，吸收峰出现在2θ为19.7 °、21.2 °、23.6 °和26.9 °等处.100 U/g环氧化PVA固定漆酶的结晶度为13.42%，10 U/g环氧化PVA固定漆酶的结晶度为4.27%左右；海藻酸钠包埋法固定化漆酶在2θ为12 °、21.8 °、32.1 °、45.7 °、56.8 °等处出现尖锐的吸收峰，结晶度为19.30%.

由图7(c)与图7(d)的对比可知，海藻酸钠固定化漆酶分子结构发生了较大变化，峰强度明显减少，结合XRD衍射测定，可证实在海藻酸钠固定化漆酶方法中，漆酶被包埋在海藻酸钠内部；图7(a)、图7(b)分别测定了环氧化PVA固定不同酶活漆酶的XRD分析，可以看到两图峰强度都有所增高(相对图7(d)游离漆酶)，这是因为环氧化PVA固定漆酶原理为表面吸附，这使得酶分子重叠结合在一起，增加了对应峰值的强度.

(a)100 U/g PVA

(b)10 U/g PVA

(c)100 U/g海藻酸钠

(d)游离漆酶图7　固定化漆酶的XRD图

2.6能谱分析

使用带能谱分析的扫描电镜进行测试，其结果如表5所示.扫描电镜所获得各种信息的二维强度和分布与试样的表面形貌、晶体取向及表面状态等因素有关[13,14].能谱分析能在短时间内对元素进行定量和定性分析，其分析体积小、绝对灵敏度高[15].

表5　固定化漆酶的能谱分析

针对S、Na两种元素进行数据分析，海藻酸钠包埋法与环氧化PVA吸附法固定化处理漆酶中均含有这两种元素，而空白载体本身不含S元素和Na元素.这是因为漆酶是一种生物蛋白质，本身含有少量的硫源；并且在实验中，使用醋酸钠醋酸缓冲溶液对酶液进行稀释，引入了Na元素.由此可以推测，固定化漆酶样本中所含有的S元素来自漆酶，而Na元素则是在制备漆酶溶液时带入.即S、Na元素来源于漆酶及其缓冲液.

针对Cl元素和Ca元素进行分析，环氧化PVA吸附法固定化漆酶及空白载体不包含这两种元素，海藻酸钠法固定化漆酶及空白均包含这两种元素，且固定化漆酶中含量较空白载体有所上升.这是因为在实验过程中使用氯化钙溶液对海藻酸钠进行了清洗，Cl元素和Ca元素在此过程中引入.

结合S、Na两种元素分析可知，漆酶被固定到海藻酸钠载体上.固定化处理前后，两种固定化方法、四个样本均含有C、O元素，经过固定化处理后，C、O元素的质量分数均有所下降，漆酶、海藻酸钠及环氧化PVA载体本身均含有碳源和氧源，漆酶与两种载体分别结合后，C、O元素的相对含量发生了变化.

能谱分析的目的是为了从元素组成角度来验证漆酶固定在载体上的确定性.这是因为漆酶的固定会引起元素质量分数的变化，从而验证了漆酶固定化的事实.另外，能谱分析是对样品表面局部进行线扫描分析，其半定量测试结果与表4酶活结果虽不一致，却恰巧说明了环氧化PVA被吸附在样品表面而海藻酸钠载体包埋机理的事实.这是因为酶活的测定结果表示的是底物与参加反应的漆酶所得产物的吸光值经计算之后的结果，而能谱则是对样品表面进行半定量分析，其所诉的固定机理一致.

3结论

(1)漆酶经固定之后，依然有分解转化底物的能力.海藻酸钠包埋法处理的固定化漆酶活力高于环氧化PVA吸附法处理的固定化漆酶活力，且包埋法固定漆酶在实际应用中更易回收并更加稳定.

(2)漆酶分子大小处于一个较为集中的范围内，其粒径大小在μm级，主要集中分布在11.482～19.953μm，占总体的70.44%，这可为不同的固定化方法提供了可行依据.

(3)SEM分析表明，海藻酸钠包埋法和环氧化PVA吸附法都可达到游离漆酶固定化的目的.其中，海藻酸钠包埋法固定化漆酶的效果更加显著，包埋在载体内部的酶分子数量更多，固定更牢固，不易脱落，在500倍放大情况下已经看得十分清楚.

而环氧化PVA载体固定漆酶是以吸附作用实现漆酶的固定化.因此,经PVA吸附法固定化处理的游离漆酶吸附在载体表面，且多为更容易实现吸附作用的小粒径酶分子，在放大3 000倍的情况下才可看到.

(4)XRD分析表明，游离漆酶在固定化前后其结晶度发生了变化.采用环氧化PVA吸附法固定化漆酶的结晶度受漆酶活力的影响，固定化使用的游离漆酶活力越高，结晶度越高；在相同活力下，海藻酸钠包埋法固定化漆酶的结晶度高于环氧化PVA.

(5)在能谱分析中，S元素、Na元素的定量测定，为游离化漆酶的固定化提供了有力支持.

参考文献

[1] 李松礼，洪卫，杨海涛，等.制浆造纸综合废水深度处理技术[J].中国造纸，2006，25(6)：71-72.

[2] GB3544-2008,制浆造纸工业水污染物排放标准[S].

[3] 郭仁妹.漆酶及其固定化[D].上海:东华大学,2009.

[4] Leiviskä Tiina,Rämö Jaakko,Nurmesniemi Hannu.Size fractionation of wood extractives,lignin and trace elements in pulp and paper mill wastewater before and after biological treatmentp[J].Water Research,2009,43(13),3 199-3 206.

[5] 周慧华,张安龙,赵登,等.固定化漆酶深度处理制浆造纸废水[J].水处理技术,2013,39(9):57-60.

[6] Sen Wang,An Long Zhang,Xin Ping Li,et al.Study on advanced treatment of pulping and papermaking process effluent by immobilized laccase[J].Advanced Materials Research,2011,233-235:712-715.

[7] 张佳,张安龙,景立明.漆酶最佳固定化条件研究[J].中国造纸,2013,32(7):37-41.

[8] 赵亮亮,谌斌,李燕荣,等.红芝组成型漆酶酶学性质的研究[J].北方园艺,2010(5):138-140.

[9] 中野凖三.木质素的化学[M].高洁，鲍禾，李忠正.北京：轻工业出版社，1988:519-523.

[10] 郑文爽.漆酶的固定化及其对偶氮染料的脱色降解[D].哈尔滨：东北林业大学,2012.

[11] 魏靖明，张志斌，冯华林，等.海藻酸钠作为药物载体材料的研究进展[J].化工新型材料,2007，35(8):20-22.

[12] 曹林秋.载体固定化酶原理、应用和设计[M].北京:化学工业出版社,2005:42-45.

[13] 吴立新，陈方玉.现代扫描电镜的发展及其在材料科学中的应用[J].武钢技术，2005，43(6)：36-40.

[14] 廖乾初，蓝芬兰.扫描电镜分析技术与应用[M].北京： 机械工业出版社,1990.

[15] 闫洪.扫描电子显微镜和X射线显微分析原理及在镀层测试上的应用[J].机电元件,1994,14(3):27-31.

【责任编辑：晏如松】

Study on morphological characterization and immobilization of laccase

ZHANG An-long, XI Wen-jun, DU Fei, ZHOU Dan-ni, YANG Nan

(Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The use of immobilized laccase in papermaking wastewater treatment can significantly reduce the residual lignin content in water.The use of SEM,XRD,laser particle size, energy spectrum analysis can provide an effective evaluation method for laccase immobilization.The molecular size of the laccase was mainly concentrated in the 11.482～19.953 μm.The principle for immobilization of laccase by sodium alginate and PVA were internal embedding and surface adsorption respectively.The particle size and the number of the enzyme molecules in the sodium alginate embedding method were large and fixed firmly and not easy to fall off;Epoxidized PVA immobilized laccase tended to absorb small particles and vulnerable to environmental impact,so the fixed affect was poor.Under the same activity,the crystallinity of the immobilized laccase by sodium alginate was higher than that of the PVA adsorption method.The qualitative analysis of the sulfur and sodium elements confirmed the effect of laccase immobilization.

Key words:lignin； immobilized laccase； SEM； XRD； morphological analysis

中图分类号：X793

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)02-0006-06

作者简介:张安龙(1962-)，男，陕西延安人，教授，研究方向：工业废水处理技术及废弃物资源化应用

基金项目：国家十二五科技支撑计划项目(2011BAC11B04)； 陕西科技大学博士科研启动基金项目(BJ14-09)

收稿日期:2015-12-10