亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

吴建忠（黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨　150086）



亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

吴建忠
（黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086）

摘要：研究通过克隆亚麻纤维素合成酶LusiCesA1基因，利用抑制差减杂交（SSH）技术，以DIANE LusiCesA1基因敲除RNA为Tester，常规RNA为Driver，构建亚麻纤维素合成酶cDNA文库，逆向斑点杂交验证阳性克隆，筛选差异表达克隆，鉴定出LusiCesA1上调表达增强基因122个，其中95个与已知功能基因同源，其余27个未知同源序列推断为亚麻纤维素合成途径新基因。LusiCesA1是亚麻纤维素合成途径关键酶基因，通过其上调表达作用机理分析，挖掘纤维合成过程上调表达基因，可改良亚麻品种。

关键词：亚麻；LusiCesA1；上调表达；差减杂交

吴建忠.亚麻LusiCesA1上调基因表达研究[J].东北农业大学学报,2016,47(3):44-51.

WU Jianzhong.Study on gene up-regulation expression of LusiCesA1 in flax[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):44-51.(in Chinese with English abstract)

亚麻（Linum usitatissimum L.）是世界主要韧皮纤维经济作物之一，在纺织、化工、建材、装饰、医药等行业广泛应用，经济附加值较高[1]。我国亚麻生产存在出麻率低、纤维品质差等问题。通过对亚麻纤维产量相关性状分析表明，纤维产量提高首先要考虑原茎高产[2]，目前传统育种手段很难在短时间内取得显著成效，分子克隆手段可弥补亚麻育种这一空缺，因此克隆亚麻纤维素合成途径关键基因，揭示其分子控制机理，探索其上调表达相关基因，可为从基因源头获得优质、高纤维亚麻新品种奠定基础。

纤维素合成酶在亚麻纤维素合成途径中起重要作用，探明纤维素合成酶关键基因作用机理，研究其在亚麻纤维合成过程中调控表达模式，对亚麻品种改良具有指导性作用。因此，研究纤维素合成酶（CesA）基因具有重要意义。纤维素合成酶基因编码纤维素合成酶的催化亚基，转录范围3.0～3.5 kb，其内含子和外显子边界区域高度保守，基因结构差异取决于内含子数量。目前已有研究证明，初生、次生细胞壁形成过程中，纤维素合成涉及不同纤维素合成酶。但每个纤维素合成酶彼此相关、协同作用，CesA已形成一个庞大的基因家族。纤维素合成酶CesA1是该酶家族重要成员，拟南芥纤维素合成酶AtCesA1序列结构特点已被深入解析[3-4]。一个类似于锌指状或LIM转录因子构象存在于植物纤维素合成酶N末端[5-6]，A区和B区是植物纤维素合成酶基因特有保守区，A区含有几个保守天冬氨酸残基，B区则与纤维素催化活性有关，另外，纤维素合成酶基因8个跨膜区是β-1，4-葡萄糖苷链穿过质膜进入细胞壁重要通道[7]。

目前国内外已对拟南芥[8-9]、棉花[10]、杨树[11-13]、玉米[14-15]等植物纤维素合成酶基因开展大量研究，拟南芥AtCesA1基因几乎在植物各个部位均有表达，且表达水平远高于其他同族基因，对初生壁纤维素合成起重要作用。杨树PtrCesA1在木质部与韧皮部高度表达，在植物细胞次生壁高质量纤维素合成中起关键作用[16]。苎麻中纤维素合成酶基因BnCesA1已成功克隆并表达分析，推测该基因参与苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素合成[17]。

2000年国内首次报道亚麻转基因培养研究[18]，成功获得再生植株，建立农杆菌介导的亚麻转基因系统，在利用转基因技术培育亚麻新品种选育工作中发挥作用[19]。近年，亚麻纤维素合成酶基因LusiCesA1已被成功克隆[20-22]，GenBank登录号：EF214742，研究表明，LusiCesA1在亚麻各个部位均有表达，表达水平远高于纤维素合成酶基因家族中其他基因，因此该基因作用机理对整个亚麻纤维素合成具有重要作用。但亚麻纤维素合成研究有待深入，仅依据部分基因片段分析并不能对基因功能和基因调控研究做详细了解，因此，获得LusiCesA1基因全长序列，进一步深入研究其表达与调控基因，将为亚麻纤维素生物合成及功能分析奠定基础。本研究通过基因敲除手段获得亚麻LusiCesA1缺失突变体，构建SSH抑制消减文库，筛选差异表达序列进行BLAST比对及功能注释，测定分析上调表达cDNA片段，检测目标基因调控因子，发掘其调控基因，为亚麻纤维素合成研究提供新思路。

1　材料与方法

1.1材料

本研究在黑龙江省农业科学院经济作物研究所亚麻基因工程实验室进行，纤维型亚麻DIANE茎干采自黑龙江省农业科学院亚麻试验圃，超低温冰箱保存后试剂盒（Plant RNA Kit，Omega）提取RNA。逆转录酶、Eco R I均购自Promega公司，TaKaRa LA Taq聚合酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、T4DNA连接酶、耐热性DNA聚合酶LA Taq®DNA Polymerase、pMD18-T均购自宝生物工程（大连）有限公司，NA凝胶回收试剂盒：AxyPrepTM，Axygen Biosciences，Inc，USA；化学试剂均为分析纯。

大肠杆菌JM109（购于北京索莱宝科技有限公司）由黑龙江省农业科学院经济作物研究所保存。LB培养基培养，菌悬液中加15%甘油于-80℃保存。载体pMD18-T，-20℃保存。质粒提取溶液参照文献[21]配制。

1.2方法

1.2.1亚麻LusiCesA1基因克隆及功能验证

1.2.1.1亚麻LusiCesA1基因克隆

本研究室前期已克隆亚麻LusiCesA1基因[22]，为深入研究该基因，在已知全长cDNA序列上设计引物，利用PCR扩增LusiCesA1基因gDNA，扩增方法参照文献[21]。利用软件Primer Primier 5.0和Oligo 6设计扩增引物WDNA-sense和WDNA-anti。PCR引物序列如下：

WDNA- sense:5'GTCTCGGGCACCTTCGCTAT CC 3'

WDNA-anti：5'CCCCGATATCCAGGGAGGTG 3'

取4 μL PCR扩增产物，1.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳，5 V·cm-1下电泳30 min，溴化乙锭染色10 min后，凝胶成像系统上检测并拍照。

1.2.1.2 Inverse-PCR扩增LusiCesA1基因gDNA侧翼序列

酶切反应参照TaKaRa公司产品目录，反应体系置于37℃下反应10 h，将产物于65℃放置1 h，使内切酶失活后连接，微量离心管中制备连接反应液（10×T4DNA Ligase Buffer 15 μL、T4DNA Ligase 1 μL、酶切产物DNA 95 μL、ddH2O补至150 μL），反应体系置于16℃下水浴4 h，回收连接产物，补水至500 μL，等体积氯仿/苯酚（V/V= 1/1）抽提1次，12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，再用-20℃预冷100%乙醇洗涤1遍，置37℃干燥10 min后，30 μL 1×TE溶解10 min。

巢式PCR扩增设计引物见表1，DNA聚合酶使用LA Taq®DNA聚合酶，具体使用方法参照说明书。以LO1RO1和LO2RO2外引物对第一次PCR，一扩产物稀释50倍后，以LI3RI3和LI4RI4内引物对第二次PCR，扩增反应体系同第一次PCR。

1.2.1.3目的片段回收及纯化

将二次PCR得到扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，分离片段参考试剂盒说明书回收目标片段。

1.2.1.4重组质粒提取、鉴定、保存及测序

将回收纯化DNA和克隆载体pMD18-T相连接，连接体系如下：4.5 μL DNA，0.5 μL载体pMD18-T，5 μL solution，16℃水浴连接过夜，重组质粒热激转化法构建和大肠杆菌感受态制备，经PCR鉴定的阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ）测序。

1.2.1.5克隆序列分析

1.2.2利用SSH技术构建亚麻纤维素合成酶基因功能cDNA文库

1.2.2.1亚麻叶片mRNA分离

利用试剂盒抽提RNA，经回收纯化后，采用寡聚（dT）纤维素柱（Oligo dT Cellulose）mRNA层析纯化，mRNA纯化方法参照Promega公司PolyATtract®mRNAIsolation Systems操作，具体操作步骤见试剂盒说明书。

1.2.2.2 cDNA文库构建

以分离的mRNA为模板，根据BD PCR-Select®cDNA Subtraction Kit（Cat.No.637401）和BD AdvantageTMcDNA Polymerase Mix（Cat.No.639105）完成LusiCesA1基因cDNA差减抑制性杂交。以玻璃纸上亚麻叶片cDNA作为Driver，亚麻叶片cDNA作为Tester，构建LusiCesA1基因正向SSH cDNA文库；同理构建LusiCesA1基因反向SSH cDNA文库。

表1　PCR扩增引物设计Table 1 Designed primer of PCR amplification

1.2.3 SSH cDNA文库克隆插入片段检测

二次PCR产物经回收试剂盒纯化后用于T载体连接，方法参照文献[1]。连接产物与大肠杆菌感受态细胞JM109混匀置冰上1 min后电击转化，加入1 mL SOC培养液37℃150 r·min-1振荡培养1 h。采用PCR扩增检测插入片段大小。

究其原因，非洲的工业基础非常薄弱，很多国家只能生产一些初级工业品，主要依靠出口原材料来换取工业制成品和消费品，因此商品匮乏，物价昂贵。

PCR反应体系为：1×PCR buffer（含Mg2+）2.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 mmol·L-1随机引物各1 μL，1 U TaqDNA聚合酶，1 μL过夜培养的新鲜组培，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：95℃变性5 min；95℃30 s，68℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃完全延伸10 min。PCR结束后，取5 μL PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。

2　结果与分析

2.1 LusiCesA1基因gDNA的PCR扩增

利用引物WDNA-sense & WDNA-anti对亚麻DNA进行PCR扩增，回收产物并测序，获得1.825×103bp的gDNA部分片段（见图1）。序列比对发现与实验室前期得到的cDNA片段相比，gDNA多53 bp，推定为内含子。总RNA抽提完毕后0.8%琼脂糖凝胶上电泳检测其完整性，紫外分光光度计测定其浓度和纯度。

图1　PCR扩增LusiCesA1基因gDNA片段Fig.1 gDNA fragment of PCR amplified LusiCesA1 gene

2.2 LusiCesA1基因gDNA侧翼序列Inverse-PCR扩增

采用Inverse-PCR技术扩增LusiCesA1基因双侧序列，产物电泳结果如图2和3所示。SacⅠ对亚麻基因组DNA酶切后PCR扩增的二扩产物中，LusiCesA1基因左侧序列有一条约2.2×103bp带纹，右侧序列有一条约3.2×103bp带纹，分别将回收产物转入克隆载体pMD18-T，测序拼接。

2.3 LusiCesA1基因序列全长及相关分析

通过Inverse-PCR扩增和序列拼接，最后得到全长共6.423×103bp的DNA序列。利用Softberry阅读框（ORF）预测，发现该核苷酸序列包含一个1.875×103bp完整开放阅读框和两个假定内含子，分析得出该基因全长序列（从ATG到Poly A），见图4。该基因推定编码一个584氨基酸的蛋白，序列见图5。编码蛋白氨基酸序列在NCBI上进行同源性比较，发现该序列与其他物种磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶（Phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase，PRAT）具有高度同源性，编码蛋白命名为LUSICESA1。

图2　Inverse-PCR扩增LusiCesA1基因gDNA左侧序列Fig.2 Left sequence of gDNA from inverse-PCR amplified LusiCesA1 gene

图3　Inverse-PCR扩增LusiCesA1基因gDNA右侧序列Fig.3 Right sequence of gDNA from inverse-PCR amplified LusiCesA1 gene

2.4差减文库构建

2.4.1差减杂交产物选择性PCR扩增结果

根据BD PCR- SelectTMcDNA Subtraction Kit（Cat.No.637401），通过两次差减杂交，进一步富集差异表达cDNA，巢式PCR选择性扩增，所用PCR引物为：

primer 1：5' TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3'

primer 2：5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3'

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示差减产物选择性PCR扩增片段长度分布在0.2～1.2 kb，为均匀弥散状，无明显主带，表明接头连接效率较好，符合建库要求。

图4　LusiCesA1基因序列全长Fig.4 Full-length sequence of LusiCesA1gene

图5　LusiCesA1基因推定编码的蛋白序列Fig.5 Encoding putative protein sequence of LusiCesA1 gene

2.4.2差减杂交文库质量控制

纯化后扩增产物连接载体pMD18-T并转化大肠杆菌JM109，37℃过夜培养，挑取白色克隆2 304个，接种于LB（含Amp）培养基，37℃振荡培养过夜，克隆的扩增检测表明，共获得1.536×103个插入片段，分布在0.2～0.7 kb（见图6）。

图6　亚麻LusiCesA1基因SSH文库中克隆的cDNA插入片段Fig.6 cDNA insertion fragment of the SSH Library from the LusiCesA1 gene of flax

2.5反向Northern杂交筛选差异表达克隆

将插入片段反向Northern斑点杂交（见图7），筛选杂交后信号有变化的克隆为阳性克隆，其代表基因片段可能与LusiCesA1基因表达相关，共获得150个信号差异明显克隆，占克隆总数10%。

2.6差异克隆测序及同源性分析结果

对差异克隆测序后，获得表达量明显增强的差异表达序列（ESTs）122个，利用DNAMAN软件去除载体序列，检测发现插入的cDNA长度均在400 bp左右，与PCR扩增结果相似。经Blastx同源比对，共95个克隆序列与已知基因有同源性，27个克隆未搜索到同源性序列。

2.7功能分类

结合MIPS和GO基因功能分类标准，根据所推定不同种类MIPS基因功能分类，结果表明，测序获得的基因功能广泛，分为12类，分别涉及代谢途径13%、蛋白质命运9%、蛋白质合成8%、能量6%、信号传导5%、细胞运输4%、细胞防御2%、转录1%、细胞骨架1%、调控1%、细胞循环1%和未分类蛋白49%（见图8）。根据基因功能分析结果，发现其中可能对亚麻LusiCesA1基因上调表达的基因功能克隆主要有三类：代谢途径、蛋白质命运、蛋白质合成，所占比例达30%，推断未知功能基因（49%）中极有可能含有与LusiCesA1基因调控纤维生物合成相关的新基因。

图7　亚麻LusiCesA1基因SSH cDNA文库差异筛选Fig.7 Differential screening of SSH cDNA library of LusiCesA1 gene

图8　亚麻LusiCesA1基因上调表达的基因功能推定（MIPS分类）Fig.8 Function estimation of up-regulated gene of LusiCesA1

3　讨　论

LusiCesA1是亚麻纤维素生物合成途径关键基因，本研究在课题组前期获得亚麻DIANE的LusiCesA1基因CDS序列基础上，通过Inverse-PCR扩增和序列拼接，首次获得LusiCesA1基因6 423 bp 的DNA全长序列，编码一个584氨基酸的蛋白LUSICESA1，与先前报道的CesA部分序列比较[20,22]，可为探究LusiCesA1基因结构及功能奠定基础，为亚麻纤维素生物合成及调控机理深入剖析提供技术支持。

利用同源重组原理开展LusiCesA1基因片段同源替代是靶标基因敲除基础，基因敲除技术路线虽不复杂，但由于亚麻内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组机率较低，筛选基因敲除成功的细胞困难。本研究通过敲除LusiCesA1基因片段的同源替代序列，利用SSH文库低丰度序列富集同时，避免敲除唯一基因目的性，结合巢式PCR技术进行目的基因片断特异性扩增，一定程度上抑制非目标序列扩增，但筛选出的大量LusiCesA1上调控表达基因，尚需进一步基因结构分析及功能验证以确定其上调表达准确性。另外，本研究中获得150个差异克隆，仅122个差异表达序列表达量明显增强，推断这些序列均为LusiCesA1上调表达基因，其中仅95个序列在数据库比对中获得同源基因，但这些基因功能尚需进一步鉴定以确定其纤维合成途径的调控作用，其余27个片段，推断为未知功能基因片段或已知基因一段序列。

4　结　论

经同源基因筛选，RT-PCR方法扩增测序获得亚麻LusiCesA1基因全长，利用抑制差减杂交技术，构建亚麻LusiCesA1基因cDNA文库，逆向斑点杂交验证阳性克隆，获得差异表达基因122个，其中27个为未知基因，其余95个为已知基因同源克隆。LusiCesA1是亚麻纤维素合成途径中影响纤维产量和品质关键酶基因，本试验为深入研究其分子作用机制，调控植物纤维合成功能奠定基础。

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Study on gene up- regulation expression of LusiCesA1 in flax

WU Jianzhong(Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Abstract:Flax cellulose synthase gene LusiCesA1 was cloned in this study,and the gene cDNA library constructed using suppression subtractive hybridization(SSH)technique,with DIANE LusiCesA1 knockout RNA as a Tester,conventional RNA as the Driver,reverse spot hybridization test positive for cloning,to screening of differentially expressed clone,the results showed that 122 genes were obviously enhanced for LusiCesA1 up-regulated expression,of which 95 gene homology with known genes,the 27 remaining unknown homologous sequence were inferred the new genes for flax fiber synthetic.LusiCesA1 was a key enzyme gene affeced the fiber yield and quality in cellulose biosynthesis,it will play a crucial role in breed improvement through analyzed its regulated expression mechanism and regulated its function in the regulation of plant fiber synthesis process in flax.

Key words:flax; LusiCesA1; up-regulated expression; SSH

作者简介：吴建忠（1983-），男，助理研究员，博士研究生，研究方向为亚麻遗传育种。E-mail:wujianzhong176@163.com

基金项目：国家自然科学基金（31401451）；国家麻类产业技术体系建设专项资金资助（CARS- 19- S03）；哈尔滨市科技创新工程青年基金（2013RFQYJ010，2013RFQYJ162）；黑龙江省农科院创新重点基金（2014ZD014）

收稿日期：2015-12-28

中图分类号：S563.2

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）03-0044-08