8种芳香胺分配系数的测定和萃取相体积的讨论

黄丽仪++周雪平++吴文宜++陈琼娟

摘要

本文测定了8种典型芳香胺的分配系数，建立并讨论了分配系数和萃取相体积、方法回收率的函数关系，基于当前芳香胺测定方法的一些已知的通用参数如回收率、水相体积等计算了最低的有机萃取试剂的用量，为方法的制定和在满足方法基本性能的前提下提升方法的环保性提供了指导。

关键词：芳香胺；分配系数；萃取相体积

化学分析步骤中的萃取是制约检测效率和检测质量的关键步骤，目标物被萃取的程度决定了方法的检出限，萃取的稳定性决定了方法的重现性，萃取需要试剂的多少决定了方法的环保性，萃取的快慢决定了检测的效率。纵观萃取技术的发展历程，液相萃取作为最早出现的萃取技术发展到现在，其在有害物质的分析中仍然具有相当旺盛的生命力。这是因为，疏水性较强、油水分配系数高的目标物往往需要利用传统液相萃取技术来达到较高萃取程度。芳香胺作为国外法规或国内强制性标准中禁止使用的致癌性物质[1]，在当前国内外通行的标准检测方法仍然采用传统液相萃取技术，无论是GB/T 17592还是EN 14362系列测试标准，一次萃取消耗的有机萃取试剂都达到80 mL[2-3]。实际上，根据分配定律，在已知的目标物分配系数的情况下，萃取率和萃取相体积以及水相体积有定量的数学关系，超过一定体积的萃取试剂并不增加萃取率。因此，测定芳香胺的分配系数和建立萃取试剂的最低使用量对指导方法的建立、兼顾方法的环保性和萃取率具有理论和实际应用价值。本文以8种典型的芳香胺为例，测定其分配系数和推算方法中有机萃取试剂的最低使用量。

1 芳香胺分配系数的测定原理

分析物在反相液相色谱柱中进行的分离过程，实际就是分析物在流动相和烃类固定相之间的分配过程。而分析物在柱子中的保留时间与其烃—水分配系数成比例，亲水性越强，越先流出，亲油性越强，越靠后流出[4]。因此，芳香胺的分配系数可以通过液相色谱保留时间的测定来推算。保留时间以容量因子来表示，即公式（1）：

（1）

其中tr为分析物的保留时间，to为死时间，即溶剂分子通过柱子的平均时间，单位为分（min）。

由于分析物的正辛醇—水分配系数的对数和容量因子有正比函数关系，即公式（2）：

logkow =a+b lgk （2）

式中，a、b线性回归系数。

可以通过相应的液相色谱条件来测定已知正辛醇—水分配系数的参比物的保留时间来计算其容量因子并作线性回归求得a和b，然后通过相同的液相色谱条件来测定分析物的保留时间，通过求得的函数关系来推算芳香胺的正辛醇—水分配系数。

2 试验部分

2.1 标样和试剂

8种芳香胺标样：2，4，5-三甲基苯胺（TMA）， 3，3-二甲基-4，4二氨基二苯甲烷（DMDAB），3，3-二甲基联苯胺（DMB），3，3-二氯联苯胺（DCB），4-氯-邻甲苯胺（CT），4-氨基偶氮苯（AAB），4，4-亚甲基-二-（2-氯苯胺）（MBCA），3，3-二甲氧基联苯胺（DCB）。以上标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。8种参比物试剂分别为：苯甲醇、4-氯苯胺、苯、氯苯、1，2，4-三氯苯、菲、荧蒽。配制使用的水为Milli-Q（德国默克集团生产）系统制备的超纯水，甲醇为色谱纯，购自美国Sigma-Aldrich公司。

2.2 仪器和色谱条件

Agilent 1260高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（Agilent）。AB204-S型精密天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。50 ?L、100 ?L微量进样针（美国Agilent公司）。Eclipse Plus C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 ?m，Agilent公司）。

柱温：35?C，进样量1?L，以超纯水（A）和甲醇（B）为流动相，流速为0.2mL/min。梯度洗脱：0.00～4.50min， 76%A，24% B；4.50min～5.00min，60%A，40%B；5.00 min～5.50min，58%A，42% B；5.50min～6.00min，57% A，43%B；6.00min～12.00min，55%A，45%B；12.00min ～16.00min，35%A，65%B；16.00min ～18.00min，60%A，40%B；18.00min～28.00min，76%A，24%B；28.00min ～42.00min，0% A，100%B；42.00min～44.00min，76%A，24%B；检测波长：240nm、254 nm、280 nm、305 nm。

2.3 标准溶液的配制

准确称取一定量的菲、荧蒽标准品，用甲醇溶解并定容，配制成浓度分别为10000μg/L、300μg/L的标准储备液。用进样针分别准确吸取一定量的甲酰胺、苯甲醇等剩余5种参比物标样，用甲醇溶解并定量，配制成浓度为15000μg/L的标准储备液。参比物标样放在冰箱（-4 ?C）中遮光保存。测试的时候根据预试验时各参比物的响应值、用标准储备液稀释成高低两种浓度的标准工作溶液。

3 测定结果

3.1 死时间to的测定

将甲酰胺的储备液稀释成60mg/kg和110mg/kg高低两个浓度梯度的工作溶液，将两个浓度的工作溶液分别进样，以保留时间相同、峰高发生变化的色谱峰进行确认，作为甲酰胺的保留时间。

3.2 参比物保留时间的测定

将参比物标样分别稀释成高低两个浓度梯度（浓度约为两倍）的单标样品，首先以高低两个浓度梯度的参比物的单标进样，以保留时间相同、峰高发生变化来确认各个单标的保留时间，然后以混标进样，再次确认各个参比物的保留时间并和各单标的保留时间进行比较。

根据各物质的保留时间和公式（1）和公式（2）求各参比物的容量因子k并计算lg k的值，查询经济合作与发展组织化学品测试导则No.117（2004）文献中推荐的各物质的分配系数和其对数值，列于表1中。

3.3 回归方程

根据表1中测定和计算获得的各参比物的容量因子和分配系数的对数值，根据第1节中的回归函数，以lgkow 对lgk作图（见图1），线性回归得到相关方程。

图1 回归方程

线性方程为：

lgkow=4.4551lgk-1.8801

相关系数为：R2=0.9464，R=0.972。

根据经济合作与发展组织化学品测试导则中对分配系数测试结果可靠性的验证规定，一组样品的测试，线性回归方程的相关系数为0.9左右测试结果才可靠[4]。本次测试获得相关系数为0.972，因此测试结果是可信的。

3.4 芳香胺保留时间的测定和分配系数的计算

将芳香胺的标准储备液稀释成15 μg/L的工作溶液并进样，获得各芳香胺的色谱图并得到相应的保留时间（见图2）。将各芳香胺的保留时间代入线性回归方式，得到各芳香胺的分配系数，见表2。

图2 芳香胺的HPLC/DAD图谱

从图2中可以看出，各芳香胺的保留时间介于参比物的保留时间之间，因此各芳香胺的正辛醇/水的分配系数不需要通过外推法计算。将经确认后各芳香胺的保留时间、容量因子k及其对数值以及根据回归方程计算获得的各芳香胺的lg kow，列于表2中。

表2 各芳香胺的保留时间、容量因子以及分配系数

3.5 分配系数和萃取试剂体积的关系

当溶液的浓度很低时，假设芳香胺在水相和有机相中分子形态完全相同，相平衡时分析物在两相中的浓度之比符合能斯特（Nernst）定律，见公式（3）。

（3）

式中，Co为分析物在萃取相中的浓度，mg/L；Cw为分析物在水相中的浓度，mg/L；kow为分配系数。

则回收率E为：

（4）

式中，为Vo萃取相的体积，L；Vw为水相的体积，L。

引入分配系数kow，则回收率为：

（5）

根据GB/T 17592或者EN 14362标准中的萃取程序，水相体积Vo通常为20mL，回收率E不低于70%，在已知各目标物的分配系数kow情况下，可以根据公式（6）计算出在满足回收率的前提下最低的萃取试剂的用量，即

（6）

Vo≥22.6 mL，即萃取试剂的使用最低不能低于22.6 mL。

4 结论

在痕量有害物质的分析过程中，传统液相微萃取技术使用较多的有机萃取试剂一直广受诟病。如何在保证方法的基本性能如较满意的萃取率的前提条件下使用最少的有机萃取试剂，其实可以利用成熟的分配定律来进行推算，然而，前提需要知道目标物芳香胺的分配系数这一基本物理化学性质，通过测定芳香胺的分配系数，再利用理论推导，可以计算出最低的萃取试剂的使用量，这个为标准方法的制定和后续改进提供了重要的指导。

参考文献：

[1] Directive， 2002/61/EC of 19 J?Ly 2002[J]. Official Journal of the European Communities， 2002，243：15.

[2] DIN EN 14362-1：2012， Textiles - Methods for determination of certain aromatic amines derived from azo colorants - Part 1： Detection of the use of certain azo colorants accessible with and without extracting the fibres[S].

[3] ISO 17234-1：2015， Leather -- Chemical tests for the determination of certain azo colorants in dyed leathers -- Part 1： Determination of certain aromatic amines derived from azo colorants[S].

[4]OECD/OCED 117， OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICCALS Partition Coefficient （n-octanol/water）， High Performance Liquid Chromatography （HPLC） Method， 2004[S].

（作者单位：广州纤维产品检测研究院）