哈蟆油发酵乳中蛋白质及氨基酸含量分析

刘同帅,邱智东,翁丽丽,郝　洁,翁　砚

(1.长春中医药大学,长春 130117；2.白求恩医科大学制药厂,长春 130012)



哈蟆油发酵乳中蛋白质及氨基酸含量分析

刘同帅1,邱智东1,翁丽丽1,郝洁1,翁砚2*

(1.长春中医药大学,长春 130117；2.白求恩医科大学制药厂,长春 130012)

摘要：目的建立哈蟆油发酵乳中蛋白质及氨基酸含量分析方法。方法运用考马斯亮蓝法测定哈蟆油发酵乳中蛋白质含量，运用氨基酸自动分析仪测定哈蟆油发酵乳中氨基酸的含量。结果3批哈蟆油发酵乳蛋白含量分别为8.050 1、8.093 0、7.758 2 mg/mL。平均总氨基酸的含量为15.320 5 mg/mL。结论哈蟆油发酵乳中含有合成人体所需蛋白质及丰富的氨基酸。

关键词：蛤蟆油发酵乳；考马斯亮蓝法；蛋白质；氨基酸

哈蟆油具有补肾益精，养阴润肺的功效。哈蟆油发酵乳由现代生物技术制得，将哈蟆油中大分子蛋白类转化为小分子物质，更利于人体吸收利用。

1材料

1.1样品哈蟆油发酵乳，由长春中医药大学中药药剂实验室提供。

1.2试剂BSA标准品(5 mg/mL)；考马斯亮蓝G-250；混合氨基酸标准溶液；95%的乙醇；85%的磷酸；HCl溶液(北京化工厂)。

1.3仪器旋涡混合器、紫外分光光度计、氨基酸自动分析仪。

2方法与结果

2.1蛋白质含量测定[1-4]

2.1.1对照品溶液的制备精密移取1 mL BSA标准品(5 mg/mL)，置于5 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线，摇匀，得1 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备精密量取哈蟆油发酵乳2 mL，置于10 mL的容量瓶中，用去离子水定容至刻度线。

2.1.3显色剂的配制考马斯亮蓝G-250染料试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，用水稀释至1 000 mL。

2.1.4线性关系考察分别精密加入BSA对照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL置于10 mL的具塞试管中，用去离子水补充至0.1 mL。再加入5 mL的考马斯亮蓝溶液，至于旋涡混合器上混匀。以去离子水作为空白，测定其在596 nm波长下的吸光度值，结果见表1。

表1　线性关系考察结果

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=0.485 38C+0.010 12，r=0.999 5。结果表明BSA对照品在0.2～1.0 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.5精密度考察精密量取BSA对照品溶液0.1 mL，依法连续测定6次，分别记录其吸光度A值，计算RSD%。结果RSD值为0.10%，说明仪器的精密度良好，其测定结果真实可信。

2.1.6稳定性考察分别精密吸取BSA对照品溶液0.1 mL，供试品溶液0.04 mL，依法测定，分别记录时间为0、4、8、12、16、20 min时对照品溶液和供试品溶液的吸光度值，并分别计算RSD%。结果对照品溶液的RSD值为0.19%，供试品溶液的RSD值为1.07%，二者在20 min之内的稳定性均良好。

2.1.7重现性考察取同一批号样品，按供试品溶液的制备方法处理，平行处理6份，依法测定吸光度值，并计算RSD%。结果样品的蛋白质含量平均值为8.422 4 mg/mL，RSD值为1.52%，表明此方法的重现性良好。

2.1.8加样回收率考察精密吸取0.02 mL已知含量(8.422 4 mg/mL)的供试品溶液，共称取6份，置于10 mL具塞试管中，以蛋白质和BSA对照品含量比例1∶1加入，依法测定吸光度值，计算加样回收率。结果平均回收率为100.74%，RSD值为2.01%，说明此方法稳定可行。

2.2哈蟆油发酵乳蛋白质含量测定取3批哈蟆油发酵乳，按供试品溶液的制备方法处理，依法测定吸光度值，并计算其蛋白质含量。结果平均含量为7.967 1 mg/mL。

2.3氨基酸含量测定

2.3.1对照品溶液的制备准确吸取一定量的混合氨基酸基准液，稀释到一定浓度，测定氨基酸标准溶液。

2.3.2供试品溶液的制备精密称取样品0.4 g置于水解管内，加入6 mol/L HCl溶液10 mL，用氮气将水解管内的空气排净，置于110 ℃恒温培养箱内水解22 h。水解完成后，常温放置冷却，将水解液转移至50 mL容量瓶中，用去离子水反复冲洗水解管，并将洗液移入容量瓶中，加去离子水定容至刻度线，摇匀，过滤，准确称取滤液0.5 mL，用氮气吹干，0.02 mol/L HCl溶液1 mL溶解，微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3测定法准确吸取20 μL混合氨基酸标准溶液及供试品溶液，用氨基酸自动分析仪进行测定。

2.4哈蟆油发酵乳中氨基酸含量测定取3批哈蟆油发酵乳，按供试品溶液的制备方法处理，按测定法进行测定，并计算其氨基酸的含量。结果见表2。

表2　氨基酸测定结果　mg/mL

3小结

哈蟆油中含有多种化学成分,其中主要成分是蛋白质[5-13],将哈蟆油利用现代生物发酵技术，制成新型保健品哈蟆油发酵乳，测得的其中蛋白质平均含量为7.967 1 mg/mL, 平均总氨基酸含量15.320 5 mg/mL。

哈蟆油发酵乳不仅改变了哈蟆油原有的口感，而且含有大量人体所需的蛋白质及氨基酸，能够增强人体的免疫力,缓解体力疲劳,作为营养保健品，具有广阔的发展前景。

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Analysis of protein and amino acid content of Oviductus Ranae in fermented milk

LIU Tongshuai1,QIU Zhidong1,WENG Lili1,HAO Jie1,WENG Yan2*

(1.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.The Pharmaceutical Factory,Norman Bethune Medical University,Changchun 130012,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for analysis of protein and amino acidcontent of Ranae Oviductus fermented milk.MethodsUsing Coomassie bright blue for determination of Ranae Oviductus fermented milk protein content,determination of the content of amino acids by automatic amino acid analyzer.ResultsThe three batch of Ranae Oviductus fermented milk protein content were 8.050 1,8.093 0,7.758 2 mg/mL.The average total amino acid content was 15.320 5 mg/mL.ConclusionRanae Oviductus in fermented milk containing synthetic human body needs protein rich amino acids.

Keywords：Ranae Oviductus fermented milk;Kaumas Bradford method;protein;amino acid

(收稿日期:2015-11-30)

文章编号：2095-6258(2016)02-0261-03

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

*通信作者：翁砚，女，工程师，电话-17804315162，电子信箱-weng1969@sohu.com

作者简介：刘同帅(1991-)，女，硕士研究生，主要从事中药学研究。

基金项目：吉林省科技发展计划项目(20120912)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.014