细菌生物被膜定性和定量研究方法

陈朝喜

摘要：细菌生物被膜是浮游细菌和生物被膜细菌共同分布于同一生存空间内的特殊生长方式，能够逃避抗生素和机体免疫系统的清除而得以继续生存。对细菌生物被膜定性和定量方法进行了综述，比较和分析了其优缺点，旨在评价各种方法在生物被膜研究中的适用性。

关键词：细菌生物被膜；浮游细菌；定性方法；定量方法

中图分类号：Q939.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2177-04

细菌生物被膜是细菌将其自身包裹在其分泌物内形成的一种特殊复合体，具有不同于浮游细菌的一些特殊性质，如生物被膜形成后造成细菌对外界环境的抵抗能力增强，在临床上形成对常用抗菌药物的耐受性，使得细菌性感染疾病迁延不愈和持续反复发作，给疾病治疗带来一定的难度。随着研究方法的发展和多学科研究领域的交叉和拓宽，近年来细菌生物被膜的定量和定性研究方法越来越完善，这些方法根据原理大致可分为三类：①基于生物被膜胞外基质和生物被膜内的总细胞数量（包括活细胞和死亡细胞）的定量试验：⑦基于活细胞的活菌计数试验：③基于生物被膜胞外基质成分的定量试验。在相关研究中，研究者对生物被膜的结构、活性和细菌组成动态变化规律等方面研究取得了很大的进展，尤其是无损伤的、原位的和在线的技术能够提供自动的、快速的和实时的信息，为生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比较了几种常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的优缺点，以期评价各方法在生物被膜研究中的适用性。

1 常用生物被膜定性研究方法

生物被膜定性研究方法主要借助各种染色方法（如银染法）、光学和光谱学方法（如光学和电子显微镜技术等）进行生物被膜检查和监测，尤其是显微检查技术在观察选取生物被膜细菌群体的结构参数和构效关系方面具有明显的优势。在生物被膜定性研究中，最常用的方法有以下几种。

1.1 快速银染法

快速银染法主要用于细菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通过快速银染法能够将细菌生物被膜中的多糖蛋白复合物染成灰褐色或灰黑色，通过银染能够初步判断不同培养阶段生物被膜中多糖蛋白复合物的动态变化规律，其操作步骤具体包括10个操作步骤：①基质材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸馏水漂洗；④氯化钙结合；⑤蒸馏水漂洗；⑥硝酸银染色；⑦对苯二酚显色；⑧蒸馏水漂洗：⑨硫代硫酸钠固定：⑩蒸馏水漂洗。

1.2 玻璃试管法

其原理是根据气-液界面形成染色环状物的颜色深浅来判定细菌生物被膜的形成能力。常用的染料有结晶紫和刚果红等，由于该方法存在一定的主观误差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步筛选。

1.3 基于电子显微镜的定性方法

借助原子力显微镜、透射扫描电镜和激光聚焦显微镜等对细菌生物被膜进行观察，能够对生物被膜的立体结构进行定性分析。尤其是相关染料与激光共聚焦显微镜相结合，能够实现对生物被膜中细菌生理状态的定性和定量分析。相关电子显微镜定性研究方法的缺点是实验条件要求较高，实验设备较贵重，因此不常用于常规检测和研究。随着电子显微镜技术的发展，近年来，在实际的科研中。电子显微镜相关技术常与染色技术和分子生物学技术结合，广泛应用于细菌生物被膜的定性和定量研究。

2 生物被膜定量研究方法

2.1 琼脂平板菌落计数法

琼脂平板计数法是一种最基本的菌落计数法，在实际的实验操作过程中不仅劳动强度大，而且费时，同时误差较大，不适宜大样本观察。虽然可以通过多次计数求平均值的方法来减小实验误差，然而这样无疑会增大工作量和强度，因此在实际实验中很少单独采用，常常结合其他方法对细菌生物量进行定量研究。在生物被膜细菌计数过程中，需要辅助手段将生物被膜中的细菌游离，辅助手段对被膜细菌的影响也制约着琼脂平板菌落计数法的重复性。

2.2 结晶紫（CV）染色法

结晶紫是一种碱性染料，能够结合生物被膜表面带负电荷的表面分子和胞外基质中的多糖成分，通过测定吸光度来对细菌生物被膜形成能力进行鉴定和分型。由于生物被膜中的胞外基质成分和细菌本身（包括活细胞和死亡细胞）均能被结晶紫染色，因此改良结晶紫方法尤其不适合用于对抗菌药物或者其他化学物质对生物被膜内细菌杀伤效果的评价。在研究中常用来对细菌生物被膜下次形成能力进行初步筛选和鉴定。

1985年Christensen等首次采用结晶紫染色方法对非黏液性链球菌生物被膜进行了定量分析，2000年，Stepanovic等对结晶紫方法进行改进，增加了结晶紫染色方法对细菌生物被膜定量的准确性，其能够对微孔板生物被膜生物量进行较为全面的量化。然而，结晶紫染色方法在铜绿假单胞杆菌生物被膜定量中具有较大的批内和批间误差，其原因可能与铜绿假单胞杆菌含有较多的水通道导致其生物被膜固定不充分有关。

2.3 Syt09/PI染色法

Syto9是一种能够对核酸进行染色的荧光染料.能够通过被动扩散的方式实行细胞膜与细菌菌体（包括活细胞和死亡细胞）的DNA结合。由于死亡细胞的细胞膜通透性改变和碘化丙啶（PI）只能穿过不完整的细胞壁的特点，PI可以进入死细胞实现对死亡细胞的染色。由于DNA也是胞外基质的一部分，因此可以通过对DNA的结合间接反映生物被膜总生物量的变化规律。

随着科研仪器的发展，尤其是激光共聚焦显微镜（CLSM）的应用之后。除了对生物被膜组成成分和形态学的研究外，Syto9/PI还常常用于细菌和酵母菌生物被膜生物量的研究。需要指出的是，在进行Syto9/PI染色时，为获取稳定的荧光信号。在测定之前需对菌株进行一段时间的孵育，而且孵育时间对不同的菌株影响较大。

2.4 MTT/XTT试验

许多四唑盐类染料如5-氰基-2，3-二-（p-苄基-四唑氯化物）（CTC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTF）、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（CCK-8）和3，3-[1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠（XTT）均能够实现对生物被膜中活细胞进行相对的定量，而且能够区别生物被膜中活细胞和死亡细胞。其中MTF/XTT试验是以活细胞的代谢能力为基础的定量化技术，是行之有效的方法之一。

活细胞线粒体中含有的琥珀酸脱氢酶能将加入的MTF/XTT代谢成为化合物甲月赞，利用酶标仪在570nm处测定细胞上清液的吸光度来反映活细胞的代谢能力，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目，已经被广泛应用在悬浮细胞的定量化以及细菌和酵母生物被膜的定量研究中。然而由于其自身不可避免的种内和种间变异较大的缺点限制了其在实际中的应用，只能用来检测细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数，因此在利用酶标仪检测结果的时候必须保证试验结果在线性范围内。此外，由于XTT水溶液不稳定，因此最好低温保存或现配现用。

2.5 试卤灵试验

刃天青又称阿尔玛蓝。是一种蓝色的化合物，可以被活细胞代谢成具有荧光活性的粉红色的试卤灵（Resorufin）。这种方法主要用于哺乳动物细胞的活性分析，也被广泛应用于真菌、结核杆菌、表皮葡萄球菌和变形链球菌的药敏试验。

2.6 荧光二乙酸（FDA）试验

活的微生物细胞能够利用其自身非特定内源性和外源性酯酶将无色的、非荧光特性的荧光二乙酸（FDA）转化成黄色的、高荧光特性的荧光物质。FDA已广泛用于土壤和垃圾中总微生物的活性监测，也广泛应用于生物被膜生物量的定量研究。

需要指出的是，在荧光二乙酸钠（FDA）试验中，为了增加生物被膜中活细胞的荧光强度，必须通过降低对照孔的荧光信号干扰来实现测定结果的最优化。此外，在利用该方法对不同种属细菌生物被膜生物量进行定量分析时，营养条件和菌株的生理特征等因素都会影响其灵敏度和重复性，因此需要建立标准曲线来校正。

2.7 1，9-二亚甲基蓝（DMMB）试验

生物膜的一个重要组成部分——胞外基质的定量也越来越引起大家的关注。研究表明，染料1，9-二亚甲基蓝（DMMB）能够和生物被膜胞外基质的硫酸聚糖络合形成一种不溶性的复合物，通过添加一种解聚试剂来间接测定和衡量生物被膜中硫酸多糖的含量。DMMB最初用于软骨细胞培养液中硫酸多糖的定量研究和金黄色葡萄球菌生物被膜胞外基质的定量研究。

2.8 多糖蛋白复合物（GLX）的测定——色氨酸定量试验

国内外学者采用色氨酸定量试验对生物被膜中的多糖蛋白复合物进行测定，利用酶标仪读取光密度值后求得多糖蛋白复合物的相对含量。生物被膜的形成不仅仅与自身的遗传因素有关，各种培养条件对细菌生物被膜胞外多糖分泌量的影响也表现出不同的结果，这也充分证实了环境条件对其也起着重要的作用。

3 小结

综上所述，上述方法尤其是FDA试验和Re-sazurin试验能够替代传统的琼脂平板计数法，而且大多数的方法简便，易行，能够对微孔板生物被膜进行定量研究，是高通量的研究方法，具有较好的重复性和适用性，能够实现试验样品的高通量操作对生物被膜生物量的测定。

大多数细菌均能够形成生物被膜来抵抗外界环境条件的改变，同时逃避机体的免疫系统清除作用。从而造成致病力的增强、持续性感染的迁延不愈和耐药性的广泛传播。在兽医领域，大肠杆菌的耐药性已成为畜牧业生产中的一个重要难题，相关报道显示不同来源的大肠杆菌均表现出不同程度的耐药性，其耐药性的发展与生物被膜的形成也有一定相关性。更为严重的是，生物被膜的形成还会带来一系列问题，包括在医学领域（例如持久性和经常性的感染）和非医学领域（例如饮用水和食品加工领域的防腐处理等）。因此，无论是在医学领域还是兽医领域，为了防止和治疗细菌生物被膜引起的感染和耐药性，必须对细菌生物被膜的病原和形成条件进行深入分析和了解，以便正确合理地选择敏感抗菌药物和生物被膜清除剂，防止细菌生物被膜造成的持续性感染和迁延不愈造成不必要的经济损失。