无瓣海桑果实内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性

覃媚　李菲　高成海　余炼　颜栋美

摘要：基于18S rDNA序列分析和GenBank同源性比较，研究采用平板分离法从红树无瓣海桑（Sonnera-tia apetala）果实中分离得到20株内生真菌，共18个属。分别对20株内生真菌的发酵液进行抑菌活性筛选，其中BGMRC1036T的代谢产物对荔枝炭疽病菌（Colletotrichumzloeosporioides）有较好的抑制作用，BGMRC1123T的代谢产物和BGMRC11095T的代谢产物对番木瓜炭疽病菌有较好的抑制作用，BGM-RCl008T的代谢产物对香蕉黑星病菌（Cladosporiumcucumerinum）表现出较好抗菌活性。

关键词：内生真菌；分离；鉴定；抗菌活性

中图分类号：$432.4⁺4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2252-04

内生真菌（Endophvte）是指那些在生活史的某一段时间能够与健康的宿主组织形成互利共生关系，而且在短时间内不会引起宿主组织发生病变的真菌。研究表明，几乎所有植物中都有内生真菌的存在，目前已从植物内生真菌中发现多种具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、杀虫、免疫抑制、酶抑制剂或激活剂等的活性代谢产物。它们在医药业、农业的生物防治方面都显示出重要的应用价值。番木瓜、香蕉和荔枝在生长过程中容易染上一些病原菌，从而影响外观、贮藏和年产量。番木瓜炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、香蕉黑星病菌（CladosporiumcucumeFinum）和荔枝炭疽病菌分别是番木瓜、香蕉和荔枝的3种主要病害的病原菌，目前多采用苯并咪唑类和百菌清等化学药物进行防治。已有研究表明，以上3种病原菌菌株对苯并咪唑类药物的抗性由单基因控制，长期使用易引起基因突变，病原菌抗药性增强，同时，化学抗菌药物的使用也容易导致不同程度的果品污染及农药残留超标，因此寻找新型杀菌剂日益迫切。

红树植物常年处于高温、高盐、频繁潮汐、缺氧、强风、强紫外线的独特环境中，致使其内生真菌次级代谢产物结构类型丰富多样，是许多具有各种活性的先导化合物的重要来源之一。本研究从无瓣海桑（Sonneratia apetala）果实中分离鉴定其内生真菌，并对其进行18S rDNA基因鉴定，以确定其分类学地位。同时进行抗菌活性测试，从中筛选出具有抗菌活性物质的产生菌，为新型抗农业病原菌药物的研究、开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 无瓣海桑果实，采集于广西钦州茅尾海红树林自然保护区。

1.1.2 培养基 ①PAD固体培养基：葡萄糖2%、琼脂2%、马铃薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去离子水配制pH6.5：⑦Trehalose-Aspartc Acid（M4）：L-天冬门酰胺1.0g、海藻糖5.0g、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；③Arginine（M9）：精氨酸1g、甘油6mL、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；④AGG纯化培养基：淀粉10g、甘油5mL、葡萄糖1g、复合盐溶液10mL、去离子水1000mL、琼脂粉14g、pH7.2-7.4；⑤PDA液体培养基：葡萄糖2%、马铃薯20%、海水素3.3%、氯霉素0.01%、去离子水配制pH6.5：⑥LB纯化培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、pH7.4，去离子水1000mL。

复合盐溶液：KNO₃1.000g、NaCl0.500g、MgSO₄·7H₂O0.500g、K₂HPO₄0.500g、NH₄NO₃0.100g、FeSO₄0.010g、MnCl·H₂O0.001g、ZnSO₄·7H₂O0.001g、去离子水100.000mL。

1.1.3 指示菌 番木瓜炭疽病菌、香蕉黑星病菌、荔枝炭疽病菌。

1.1.4 主要仪器设备 高压灭菌器（HVE-50，日本HIRAYAMAHVE公司）、恒温培养振荡器（ZHWY-2112C，上海智城分析仪器制造有限公司）、多功能梯度PCR仪（TGradient，德国Biometra公司）、电泳仪（TanonEPS-100，上海天能科技有限公司）、冷CCD凝胶成像分析系统暗箱（GelLogic2200Pro，Carestream公司）、旋转蒸发仪（N-1100D-W，日本EYELA公司）。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离纯化 取无瓣海桑果实，用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸干水分。无菌条件下对其表面消毒：次氯酸钠（含5%有效氯量）浸泡3min→无菌水冲洗3次→75%乙醇浸泡1min→无菌水冲洗3次，并用无菌滤纸吸干表面无菌水。将无瓣海桑果实切成0.5cm×0.5cm的小块并进行研磨，研磨好的样品加入1mL无菌水，混匀后，作为10^-1的植物悬液，再依次制成10^-2、10^-3稀释度的样液，分别取各梯度稀释后的样液0.2mL，分别接种于PDA、M4、M9和AGG4种不同培养基中，28℃培养15d后进行菌落计数和菌株分离，同时做表面消毒效果对照处理：①将最后1次洗涤无菌水吸取100μL接入培养基中，同等条件下观察培养。⑦在操作台上置1个始终开盖的培养皿，同等条件下观察培养。如果对照组培养过程中无微生物出现，表明分离得到的菌株是无瓣海桑果实内生菌，而不是表面的附生菌。

1.2.2 菌株的鉴定 分子生物学鉴定：分别用Chelex100法提取菌株基因组DNA为模板，以真菌通用引物NL1（5'-GCATATCAATA-AGCGCAGGAAAAG-3'）和NI4（5'-GGTCCGT-GTTTCAAGACG-3'）为上下游引物扩增菌株的18SrDNA。PCR反应体系为（20μL）：无菌水15.6μL，10xBuffer2.0μL，dNTPs（2.5mmol/L）0.4μL，NL1（10pμmol/L）0.4μL，NI4（10μmol/L）0.4μL，基因组总DNA1μL，LATaaDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸1s，共30个循环，循环结束后。72℃延伸维持10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托北京华大基因研究中心进行测序。测序结果用Blast软件在GenBank进行同源性比较，以Glustalx进行多序列比对后，运用MEGA5.0软件。采用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.3 菌株的发酵及次级代谢产物的提取 种子培养基和发酵培养基均采用PDA液体培养基。种子液装入250mL的三角瓶，每瓶加入120mL培养基。121℃灭菌15min。冷却至室温。从平板上接入适量菌种，将分离鉴定得到的真菌菌株接入其中，每个三角瓶接一环。将已接种的三角瓶移至恒温培养振荡器中，150r/min、28℃的摇床上培养7d，将每株真菌菌株分别转接到5个500mL三角瓶中，每瓶200mL培养基，于150r/min、28℃的摇床上培养7d。发酵得到培养液用细胞破碎仪进行细胞破碎。并用乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪浓缩。得到真菌次级代谢产物。

1.2.4 抗菌活性试验 将分离鉴定后得到的内生真菌的发酵液分别用DMSO溶液配制成浓度为5mg/mL。再各取5μL溶液添加到滤纸片（直径6mm）上。然后置于含番木瓜炭疽病菌、荔枝炭疽病菌和香蕉黑星菌的LB培养基检测平板上。空白对照为DMSO溶液，阳性对照为多菌灵（浓度为5mg/mL）。37℃培养48h。测量抑菌圉大小。判断抗菌活性。每个样品设3个平行。抑菌圈直径d≥20mm表示具有强抗菌活性：20mm>抑菌圉直径d≥10mm表示具有中等抗菌活性：10mm>抑菌圉直径d>6mm表示具有弱抗菌活性。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

从无瓣海桑果实中共分离得到20株内生真菌，分别用Chelexl00法提取菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增、委托北京华大基因研究中心进行测序，将测序结果用Blast软件在GenBank进行同源性比较，发现其中19株菌的相似性为99%，1株菌的相似性为100%，按照目前通用的真菌分类标准，具有98%～99%序列相似性的菌可以判定为同一个属。故研究分离得到的内生真菌为18个属，分别为4cidiella sp.、Aspergillus sp.、Aureobasidium sp.、Candida sp.、Cladosporium sp.、Mycosphaerella sp.、Graphiola sp.、Basidiomycot sp.、Hypocreaceae sp.、Coniosporium sp.、Meiraargovae sp.、Neopestalotiopsis sp.、Paecilomyces sp.、Penicillium sp.、Pestalotiopsis sp.、Pseudozyma sp.、Sporisorium sp.、Sporobolomyces sp.，结果如表1所示。以Glustalx进行多序列比对后。运用MEGA5.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果见图1。

2.2 内生真菌抗菌活性的筛选

从分离鉴定得到的20株内生真菌中，筛选得到4株对指示菌具有拮抗作用，其中BGMRC1036T的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径为15.0mm），BGMRC1123T的代谢产物和BGMRC1095T的代谢产物对番木瓜炭疽病菌表现出较好的抑菌活性（抑菌圈直径分别为12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代谢产物对香蕉黑星菌表现出较好的抗菌活性（抑菌圈直径为15.0mm）。分离筛选出的4株内生真菌对香蕉黑星病、番木瓜炭疽病和荔枝炭疽病具有较好的拮抗作用，具有作为生物抗菌剂的潜力。

3 小结与讨论

本研究从无瓣海桑果实中分离得到20株内生真菌，通过18SrDNA鉴定，并用BLast软件在Gen-Bank进行同源性比较后确定分离得到的20株内生真菌分属于18个属。从种属数量可以看出，无瓣海桑果实内生真菌的种属比较丰富，反映了红树内生真菌种属的多样性，目前已分离得到的红树林真菌超过200多种，成为海洋真菌的第二大类群。红树植物内生真菌生活环境的特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力。是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源。目前，红树内生真菌主要是从红树植物的根际土壤、根、茎、叶几个部分分离得到，从红树的果实尤其是具有一定药效的可食性红树果实中分离鉴定得到的内生真菌比较少。

本研究对分离得到的20株内生真菌分别进行了抗菌试验，筛选出4株对香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好拮抗作用的菌株。其中BGM-RC1036T的代谢产物对荔枝炭疽病菌有较好的抑制作用（抑菌圈直径为15.0Him），BGMRC1123T的代谢产物和BGMRC1095T的代谢产物对番木瓜炭疽病菌表现出较好的抑制作用（抑菌圈直径分别为12.0mm和14.0mm），BGMRC1008T的代谢产物对香蕉黑星病菌表现出较好抗菌活性（抑菌圈直径为15.0mm）。研究表明。以上4株内生真菌代谢产物对香蕉黑星病、番木瓜和荔枝炭疽病具有良好的拮抗作用，有待于进一步分离其抑菌单体，为研究新型抗农业病菌药物提供宝贵的资源。