夏枯草总黄酮的抗氧化活性研究

曹小燕　杨海涛

摘要：采用分光光度法研究了夏枯草（Prunella vulgaris L.）总黄酮的抗氧化活-性。结果表明，在浓度为0.12mg/mL时，对羟基自由基（·OH）清除率达到96%；在浓度为0.004mg/mL时，对ABTS自由基正离子（ABTS⁺·）的清除率达到99%；在浓度为0.01mg/mL时，对超氧阴离子（0₂^-·）的清除率达到92%：夏枯草总黄酮也具有较强的还原能力，证明夏枯草具有良好的还原能力和自由基清除活性。

关键词：夏枯草（Prunella vulgaris L.）；总黄酮；抗氧化；清除

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2316-03

夏枯草（Prunella vulgaris L.）为唇形科夏枯草属植物，该属植物全球约有15种，广泛分布于江苏、河南、湖北、湖南、陕西等地。夏枯草中富含苷类物质（三萜皂甙、芸香甙、金丝桃甙等）、糖类、黄酮类、挥发油、有机酸、香豆素、生物碱、咖啡酸等活性成分[，具有抗炎、降压及抗肿瘤等多种药理学活性。何力认为夏枯草对特异性免疫表现出非常强的抑制作用，其抗炎效果与肾上腺皮质中的糖皮质激素合成、分泌的增强密切相关。从夏枯草中提取出来的2α-羟基熊果酸、熊果酸、2α，3α-二羟基乌苏12烯-28酸、桦木酸具有明显的抗炎和抗过敏活性。夏枯草总三萜（TFP）可有效抑制RAW264.7细胞分泌的炎症因子，具有一定的抗炎作用。杨力等研究证明，夏枯草的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等均具有抑菌效果。夏枯草的丁醇、乙醇或氯仿提取物可以有效地舒张血管，降低血压的功效。夏枯草的75%乙醇提取物还可以升高NO含量，降低ET、AngⅡ含量，从而发挥其对SHIR大鼠的降压作用。研究表明，夏枯草总皂苷提取物可以使麻醉大鼠的舒张压及收缩压降低，临床上发现夏枯草汤剂治疗高血压的效果显著，比牛黄降压丸的效果更好。体外试验证明，夏枯草水煎醇沉粗提物对RaiiB淋巴瘤白血病细胞、JurkatT淋巴瘤白血病细胞生长均有明显的抑制效果。郑学芝等证明夏枯草提取物可抑制食管癌Eca-109细胞增殖，降低Bcl-2蛋白质表达，增加Bax蛋白质表达，从而诱导细胞凋亡。

黄酮类化合物广泛存在于植物体内，具有降低心肌耗氧量、清除体内自由基、增强机体免疫力、调血脂、降血压、防癌抗癌等药理学功能，是一类极具开发前景的天然抗氧化剂，夏枯草在中国分布广泛，资源丰富。目前，夏枯草的研究主要集中在化学成分的提取及其相关的生物学活性研究，而对其自由基清除活性的研究相对较少。本试验以夏枯草中总黄酮为研究对象，研究其自由基清除活性，并测定其还原能力，旨在为夏枯草进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

夏枯草采于陕西省汉中市汉台区，将夏枯草烘干，粉碎后待用；芦丁（自制标准品）；无水乙醇、抗坏血酸、邻二氮菲、七水硫酸亚铁、双氧水、亚硝酸钠、ABTS、过硫酸钾、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻苯三酚，均为市售分析纯。

ZXL-RS-6A型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市金祥龙电子有限公司）：SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）：GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱（中国重庆银河试验仪器有限公司）：722E型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）：FA2104N型电分析天平（上海思龙科学仪器有限公司）；TGL-16C型台式离心机（上海安宁科学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草中总黄酮的提取 取新鲜夏枯草，于60℃烘干，粉碎。称取夏枯草粉末5.027g，设定温度为80℃，乙醇体积分数为65%，固液比为1：18（g/mL，下同）的条件下加热回流2h，抽滤，残渣再次浸取抽滤，合并两次滤液。乙醇提取液浓缩至25mL，转移至250mL容量瓶中，65%的乙醇定容，得到样品分析液。

1.2.2 绘制芦丁标准曲线 精确称取经干燥至恒重的芦丁标准品20.0mg，乙醇溶解至50mL定容，配成0.4mg/mL芦丁标准溶液。准确吸取标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00mL，分别加乙醇补至10.00mL，加入5%NaNO₂溶液1.5mL，摇匀，静置6min；再加入10%Al（NO₃）₃溶液1.5mL。摇匀。静置6min。加入4%NaOH溶液15mL，用65%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，在波长510nm处测定其吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。

1.2.3 夏枯草总黄酮提取含量的测定 精确吸取样品溶液2.5mL，置于50mL容量瓶，按标准曲线的制备方法测定其吸光度，根据回归方程，计算夏枯草样品中总黄酮的含量。

1.2.4 羟基自由基（·OH）的清除 采用邻二氮菲一Fe²⁺氧化法。按以下公式计算对·OH的清除率。

·OH清除率=[（D_样品-D_损伤）/（D_未损-D_损伤）]×100%

1.2.5 ABTS自由基正离子（ABTS⁺·）的清除 将ABTS配制成7mmoL/L溶液，再加2.45mmol/L过硫酸钾，置于室温黑暗中反应12-16h，制备ABTS⁺·。使用无水乙醇稀释ABTS⁺·使其在734nm处的吸光度为0，70±0，01。加入不同体积的抗氧化剂于上述稀释的5mL自由基溶液，无水乙醇定容，于30℃水浴中放置30min，734nm处测定吸光度D_X，以不加抗氧化剂测定的吸光度为D₀，无水乙醇校零，平行测定3次。以相同浓度的维生素C作对照，按以下公式计算对ABTS⁺·的清除率。

ABTS⁺·清除率=（D⁰-D^X）/D⁰×l00%

1.2.6 超氧阴离子自由基（O₂^-·）的清除 采用邻苯三酚自氧化法。取5支15mL的离心管，各管中加入Tris-HCl（0.1mol/LDH8.2）缓冲溶液5.0mL，于37℃水浴中预热10min，在各管中依次加入不同体积的夏枯草提取液，再迅速加入预热的0.1mL邻苯三酚（3mol/L），于30s内定容至10mL，置于37℃的水浴中准确反应10min，立即用盐酸（8mmol/L）2滴终止反应，于420nm处测定各管的吸光度D样品，平行测定3次。相同试验条件下，不加任何提取液的吸光度为D_空白，夏枯草提取液吸光度为D₀，以相同浓度的维生素C作参照，按以下公式计算对O₂^-·的清除率，

O₂^-·清除率=[△D_空白-△D_样品-△D₀）]/△D_空白×100%

1.2.7 相对还原能力的测定 采用Oyaizu的方法测定相对还原能力。在不同体积的样品溶液中分别加入2.5mL0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）和5mL1%铁氰化钾溶液，混合均匀后置于37℃水浴中反应20min，再加5mL10%三氯乙酸溶液，无水乙醇定容，3000r/min离心10min。吸取上清液2，5mL，依次加入2.5mL去离子水和0.5mL0.1%三氯化铁溶液。于700nm处测定待测样品的吸光度。以同浓度的乙醇为空白，平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为A=9.6161x+0.0443，相关系数R²为0.9993。

2.2 夏枯草总黄酮含量的测定

测定样品溶液在510nm处的吸光度，代入回归方程，计算出样品中的总黄酮含量为0.8mg/mL，即夏枯草中总黄酮含量为3.98%。

2.3 夏枯草总黄酮对羟基自由基（·OH）的清除效果

由图1可知，夏枯草总黄酮的浓度与·OH的清除作用呈明显的量一效关系，清除效果随着夏枯草总黄酮浓度的增加而增强。与维生素C相比，在0.024-0.048mg/mL的浓度范围内，夏枯草总黄酮对·OH的清除效果与维生素C近似，在0.048～0.144mg/mL的浓度范围内，夏枯草总黄酮对，OH的清除效果明显高于维生素C。随着浓度的增加，维生素C对·OH的清除作用缓慢增加，而夏枯草总黄酮对·OH的清除作用快速增加。在浓度为0.12mg/mL时，夏枯草总黄酮对·OH的清除率高达96%，而相同浓度下维生素C的清除率为49%，即夏枯草黄酮对·OH的清除效果明显优于天然抗氧化剂维生素C。

2.4 夏枯草总黄酮对ABTS自由基正离子的清除效果

ABTS法被广泛用于天然产物总抗氧化能力的测定。在反应体系中，ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS自由基正离子，抗氧化剂与ABTS⁺·反应后使其溶液褪色，特征吸光度降低。吸光度越低，表明所检测物质的总抗氧化能力越强。

由图2可知，夏枯草总黄酮对ABTS⁺·的清除呈明显的量一效关系，即浓度越大。清除效果越强。夏枯草总黄酮相对于维生素C而言，对ABTS⁺·具有良好的清除效果，在浓度为0.004mg/mL时，夏枯草总黄酮对ABTS⁺·的清除率达到99%，而同浓度条件下，维生素C对ABTS⁺·的清除率为73%，即夏枯草总黄酮对ABTS⁺·的清除效果明显优于抗氧化剂维生素C。 2.5 夏枯草总黄酮对超氧阴离子自由基（O₂^-·）的清除效果

超氧阴离子自由基（O₂^-·）是生物体代谢产生的活性中间体之一，可在短时间内引发自由基链式反应。产生·OH、过氧亚硝酸根等。细胞内O₂^-·的累积可以引起线粒体膜的通透性改变，导致细胞色素C的释放，从而诱导细胞凋亡。因此。清除O₂^-·有助于维持机体的氧化还原平衡，保证机体的代谢稳定性。

由图3可知，随着夏枯草总黄酮浓度的增加，清除O₂^-·的能力逐渐增强，并且存在良好的线性关系。当样品浓度为0.01mg/mL时，夏枯草总黄酮对O₂^-·的清除率为92%，而相同浓度条件下的维生素C的清除率为21%。结果表明，夏枯草总黄酮清除O₂^-·的活性明显优于天然抗氧化剂维生素C。

2.6 还原能力的测定

由图4可知，夏枯草总黄酮具有较好的还原能力，其还原能力与浓度呈现良好的量一效关系，即浓度越大，还原能力越强，抗氧化活性越强，但与维生素C相比，差距不大。可能是因为本试验所测的还原能力是指夏枯草中总黄酮的还原能力，而清除·OH和ABTS⁺·的黄酮可能是夏枯草总黄酮中的部分黄酮。所以测得的还原能力与维生素C相比差距不大，而清除·OH、ABTS⁺·和O₂^-·时效果较好。

3 小结

通过测定，确定夏枯草提取液中总黄酮含量为0.80mg/mL。夏枯草总黄酮具有明显的抗氧化活性。在浓度为0.12mg/mL时，对·OH的清除率达到96%：在浓度为0.004mg/mL时。对ABTS+，的清除率达到99%：在浓度为0.01mg/mL时，对O₂^-·的清除率达到92%，清除效果明显优越于天然抗氧化剂维生素C，且夏枯草总黄酮也具有较强的还原能力。夏枯草在中国资源丰富，分布广泛，本研究证实其具有良好的自由基清除活性，为夏枯草的生物活性研究和资源开发提供理论依据。