流动分析法测定烟草中的酚类化合物含量

王鹏　吕祥敏　黎洪利　李力　尚军

摘要：为建立连续流动测定烟草中酚类物质总量的方法，研究了流动分析模块中氨溶液、显色剂、缓冲溶液和样品液的管径组合与样品的前处理方式。结果表明，氨溶液、显色剂、缓冲溶液和样品液的合理管径分别是0.16、0.60、0.42、0.60mL/min，样品的较好处理方式是热水浴中萃取样品45min，回收率为97.5%～102.9%，RSD=0.80%。

关键词：流动分析法；烟草；酚类化合物；测定方法

中图分类号：TS411.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2353-03

烟草中的酚类化合物种类繁多，按照羟基数目的不同，可分为简单酚类和多酚，其中简单酚含量极微。多酚类物质在调制过程中会因为过度的氧化使烟叶发生棕色化反应，这不但会影响烟叶的外观质量，也会使内部有利品质成分减少。如果比例不协调，就会导致内在质量变差。与对烟叶颜色的影响相反，一般认为多酚类物质在烟草燃吸时产生的酸性反应能够中和部分碱性，使吃味更醇和，所以多酚类物质被认为是产生烟草香气的主要成分之一，而绿原酸通常是烟叶中存在最多的多酚。测定烟叶中的酚类物质有助于了解烟草香气质量，对于指导卷烟配方设计有重要的意义。检测酚类物质使用较多的是色谱法，基本是针对其各组分的单独测定。连续流动法具有操作简单、检测速度快等特点，可以满足大批量检测需求。在烟草化学成分检测分析领域内已经得到了广泛的应用，本研究对连续流动分析法测定烟草中酚类物质的总量进行探讨。

1 材料与方法

1，1 试剂、材料与仪器

羟甲基纤维素钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸铁氨（AR，天津市大茂化学试剂厂）；乙二胺四乙酸二钠（AR，重庆川东化工有限公司化学试剂厂）：无水乙醇（AR，重庆吉元化学有限公司）：聚乙氧基月桂醚溶液（30%，荷兰SKALAR公司）；绿原酸（98%，上海将来生化试剂有限公司）。

SKALAR流动分析仪及其附件（荷兰SKALAR公司）；AX504分析天平（感量0.0001g。瑞士梅特勒公司）：P270普通摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；ZHWY-110X30恒温水浴摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；THD-M1超声波发生器（深圳市科工达超声设备有限公司）。

1.2 样品的处理和分析

称取0.5g左右烟末样品，置于150mL具塞三角瓶中，加入50mL蒸馏水，放入85℃的恒温水浴摇床中萃取45min。然后将样品冷却到室温，过滤，取滤液用于流动分析检测。烟草总酚含量检测的原理是，样品中的酚类物质与羧甲基纤维素钠和乙二胺四乙酸二钠所组成的缓冲溶液混合在一起，后与柠檬酸铁氨在碱性条件下反应，生成一种红色的染料，该物质在600nm处有最强吸收峰，以绿原酸作为标准物质，基于此对烟草中的总酚含量进行测量，检测结果以绿原酸计。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

准确移取绿原酸标准溶液5mL于50mL容量瓶中。加入5mL显色剂、10mL缓冲溶液、5mL氨溶液，再用蒸馏水稀释至刻度，静置10min。以相应的试剂空白作参比，在波长400-800nm内进行扫描（图1）。从图1中可以看出溶液最大吸收波长为605nm，所以选择600nm作为测定波长。

2.2 流动分析模块的设计

根据烟草总酚检测方法的原理，初步设计的流动分析模块见图2。

为确定总酚流动分析中氨溶液、显色剂、缓冲溶液和样品液输入量的合理搭配，筛选出检测中样品响应的最高值与基线波动的比值足够大，以期避免基线的波动对检测结果产生干扰，对其管径进行均匀试验。

2.2.1 均匀试验设计 选定的试验因素为氨溶液、显色剂、缓冲溶液和样品液的管径；试验水平为0.16、0.32、0.42、0.60mL/min等4种大小的管径，试验方案见表1。

2.2.2 均匀试验及分析 按照均匀设计的管径组合，进行流动分析模块的组装，并进行试验，试验相关结果见表2。

依据均匀试验结果，利用DPS数据处理软件，参照文献的方法，对各种试剂的管径和峰高比进行多项式回归，通过最高目标值回归得出的参数组合见表3，表中所列出的条件为峰高比最大的理论上的参数及根据实际情况选择的验证试验的条件。

从验证试验的结果看，验证1的比值为37.9，较验证2的25.3效果更好。所以确定接入分析模块中的氨溶液、显色剂、缓冲溶液和样品液的管径分别为0.16、0.60、0.42、0.60mL/min，该组合能够保证检测数据的稳定性。

2.3 样品前处理方法的选择

称取0.5g左右的烟草样品于150mL具塞三角瓶中，加入50mL蒸馏水，分别采用恒温水浴、超声波、摇床等3种萃取方式，分别萃取30、45、60min，将不同萃取方式和时间获得的样品，使用定性滤纸过滤，取滤液。用设计的流动分析模块进行总酚含量的检测，结果见表4。由表4可以看出，3种萃取方式下，萃取45min后，总酚含量基本不再变化，而超声波和摇床2种萃取方式下总酚含量基本相同，而都略低于恒温水浴萃取下样品的总酚含量。通过上面的试验比对结果，选择恒温水浴萃取样品45min。

2.4 干扰试验

因为酚类物质含多羟基或羰基，所以干扰物质主要考察了一些含羟基、酮基、羰基的物质。其中包括甲醇、乙醇、葡萄糖、果糖、丙酮、乙酸、水杨酸。结果见表5。从检测结果看（样品总酚含量为3，57%），所考察的物质除乙酸外，对总酚含量的检测无干扰。而加入低于0.2g乙酸对样品检测无干扰，出现这种情况的原因是，样品的显色需要在一定的碱性环境中进行，烟草中的总挥发酸一般也不会超过1%，所以可以说在总酚检测时，烟草自身的酸性物质不会对检测结果产生影响，也就是说所选物质对总酚含量的检测没有干扰。

2.5 回收率、精确度、检测限

称取烟草样品测定10次，其总酚含量的平均值为3.57%，RSD为0.80%，说明具有较好的重复性。

称取0.25g左右的样品，分别加入一定量的绿原酸标准物质，进行样品的处理与分析，结果见表6，从表6可以看出本法的回收率在97.5%-102.9%之间，表明测定结果比较准确。

以最低标准溶液10次检测结果的标准偏差的10倍为检测限，3倍标准偏差为检出限，检测限为0.11%，检出限为0.03%。

2.6 部分烟草样品总酚含量的检测

对来自不同地区的18个烤烟样品和12个白肋烟进行了总酚含量的检测（表7），从表7可以看出烤烟总酚含量远高于白肋烟，其中烤烟中含量最高的达到了5.58%，白肋烟中含量最低的只有0.38%。

3 小结

通过对烟草中酚类物质与柠檬酸铁氨反应生成物的最大吸收波长和各试剂管径的考察，组建了流动分析模块：并应用该模块测试了烟草中酚类物质的不同萃取方式和不同萃取时间下的含量，从而建立了烟草中酚类物质总量的流动分析方法，该方法检测快速，检测结果准确、稳定。