不同产地美味牛肝菌菌盖、菌柄的紫外光谱鉴别

杨天伟　刘鸿高　张霁　李涛　王元忠

摘要：建立采用紫外光谱技术快速鉴别不同产地美味牛肝菌（Boletus edulis）的方法，确定美味牛肝菌最佳提取溶剂和时间，制备测试液，应用紫外光谱技术建立7个不同产地美味牛肝菌菌盖和菌柄的紫外指纹图谱，光谱数据转化后进行聚类分析。结果显示，其最佳提取溶剂为氯仿，提取时间为30min；在10h内的稳定。性、方法重现。性和精密度的RSD分别在0.04%～1.73%、0.03%～0.63%、0～2.87%之间，表明该方法稳定可靠；菌盖、菌柄的紫外指纹图谱出峰位置相似，而峰高具有差异，表明不同产地美味牛肝菌化学组分相似，含量存在差异；聚类分析结果显示采自同一地区的美味牛肝菌能够很好聚类。研究表明，紫外光谱结合聚类分析能快速鉴别不同产地美味牛肝菌，可作为野生食用菌的鉴别和质量控制新方法。

关键词：紫外光谱；美味牛肝菌（Boletus edulis）；聚类分析；鉴别

中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2362-04

食药用菌是人类食物的重要来源，营养、保健价值独特，是较理想的健康食品之一。美味牛肝菌（Bofetus edulis Bull）又称大脚菇，其子实体富含蛋白质、维生素、氨基酸、多糖、矿质元素等，深受消费者的推崇，为著名食用山珍和药用真菌，是极具开发价值的药食同源型真菌。云南特殊的生境资源适宜多种野生菌生长，美味牛肝菌产量高，分布广泛。受地理、环境因素影响，不同产地美味牛肝菌化学成分、营养物质、药效等不尽相同。

传统的野生食用菌鉴别主要依据外观形貌，生长特性。显微结构，菌肉、菌管的颜色及变色反应等进行。同种食用菌在不同生长环境下出现大量表形变异，如美味牛肝菌菌盖颜色有褐色、黄褐色、红褐色或深褐色，菌管有乳白色、淡褐色。偶尔成黄绿色。其颜色变化较大：不同种类形态相似性大，不易准确鉴别。目前，对食用菌的鉴别分类的研究主要有红外光谱法和分子生物学方法，研究者利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）法鉴别不同的灵芝产品；根据不同种类食用菌红外光谱的峰高、峰形的差异结合主成分分析、聚类分析等方法鉴别不同产地、不同种类食用菌，但这种方法需要丰富的经验，难以建立完整的鉴别体系。分子生物学技术的发展为真菌分类学注入了新的活力，改变和完善了真菌分类的一些概念，魏海龙等设计5对ITS引物并对ITS区段进行PCR扩增，实现牛肝菌属卷边组Boletus sect.Appendiculati物种的相互识别。Mello等根据ITS片段设计引物，对铜色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）、美味牛肝菌等进行了分子鉴别：Lian等应用ITS设计引物辨别美味牛肝菌与其他蘑菇。分子生物学方法需具备一定学科知识背景，仪器操作复杂，价格昂贵，其推广运用具有较大局限性。

指纹图谱是运用现代仪器（光谱仪、色谱仪等）检测得到的能够基本反映成分较复杂物质内部特征的规范化图谱，具有操作简便、快速、整体性强等特点，是一种综合的质量控制或物种鉴别方法。指纹图谱不能代替成分含量测定，但所获得的信息比测定任何单一成分所提供的信息更丰富、更全面，是一种实现对样品多组分、多指标分析的理想方法。紫外指纹图谱技术根据不同物质体系紫外吸收图谱的出峰位置、峰高、峰面积等的差异，可用于鉴别不同物质体系：该项技术已被广泛应用于食品质量控制、中药材鉴别、酒类鉴别等多个领域。本研究采用紫外指纹图谱技术结合聚类分析对采自云南7个不同地区美味牛肝菌不同部位的紫外指纹图谱进行鉴别分析，为野生食用菌的鉴别分类提供辅助方法。

1 材料与方法

1.1 材料

美味牛肝菌样品：采于2011年7月，由云南农业大学刘鸿高教授鉴定，来源地见表1。

主要设备：UV-2550双通道紫外可见分光光度计（配有UVprobe工作站），日本岛津制作：K05200型超声波清洗机，昆明市超声仪器有限公司。

主要试剂：氯仿（分析纯），西陇化工股份有限公司：石油醚（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司：氢氧化钠（分析纯），西陇化工股份有限公司；无水乙醇（分析纯），云南汕滇药业有限公司；蒸馏水，自制。

1.2 样品处理

样品采集后。清洗干净。50℃烘干。每个来源地取10个美味牛肝菌子实体，菌盖、菌柄分开粉碎，过100目筛。

1.3 美味牛肝菌特征成分提取条件确定

1.3.1 提取溶剂 以样品1为考察对象，确定最佳提取溶剂。准确称取0.1000g样品于25mL比色管中，分别加入10mL蒸馏水、无水乙醇、石油醚、氯仿、0.5mol/LNaOH，每组分别平行3次；超声波提取30min。过滤，以对应的溶剂为参比液，测定紫外光谱，根据吸收峰数确定提取溶剂。

1.3.2 最佳提取时间 以样品1为考察对象，确定最佳提取时间。准确称取0.1000g样品。加入10mL氯仿，分别超声波提取20、30、40、50、60min，过滤，测定紫外光谱，根据吸收峰数确定最佳提取时间。

1.4紫外光谱测定

准确称取各样品0.1000g于25mL比色管中。加入10mL氯仿，超声波提取30min，过滤：设定紫外光谱扫描波长为190-450nm，狭缝宽度1.0nm，采样间隔0.2nm，重复测定3次。以氯仿作为参比液和测试液进行基线校正及空白测定：用UV-2550自带的UVprobe软件分析3次测定结果，扣除空白，以消除溶剂干扰，强化谱带特征。建立清晰的美味牛肝菌紫外指纹图谱，

1.5 方法学试验

以样品1为考察对象，考察重现性、精密度、稳定性。称取0.1000g样品5份，按“1.4”制备测试液，经190-450nm紫外光谱测定，计算不同波长的平均相对标准偏差（RSD），考察重现性。样品1的氯仿提取液在190-450nm重复测定6次，计算不同吸收波长的RSD，考察精密度。样品1的氯仿提取液分别在2、4、6、8、10h时进行紫外光谱测定，计算不同吸收波长的RSD，考察稳定性。

1.6数据处理

由于190-230nm紫外吸收峰受溶剂和光谱噪音的干扰严重，牛肝菌样品的紫外光谱特征吸收峰在230-450nm波长范围内，因此取230-450nm波长范围内的紫外光谱数据转置后，用SPSS19.0软件进行聚类分析，直观表征不同产地美味牛肝菌样品间的相似性。

2 结果与分析

2.1 美味牛肝菌样品的提取条件

2.1.1 最佳提取溶剂 由相同条件下用不同溶剂提取样品1的紫外指纹图谱（图1）可以看出，无水乙醇、蒸馏水和0.5mol/LNaOH提取液没有明显的紫外吸收峰：石油醚提取液的紫外吸收峰数目少且吸收峰不明显：氯仿提取液在260-300Bill波长范围内有明显的紫外吸收峰，吸收峰数目多于其他溶剂提取，确定氯仿为最佳提取溶剂。

2.1.2 最佳提取时间 以氯仿作为提取溶剂，考察不同提取时间对提取效果的影响，结果见图2，由图2可看出超声波提取时间为20min时，美味牛肝菌样品提取液的紫外吸收峰不明显：提取时间为30min时具有明显的紫外吸收峰，此后延长提取时间，吸收峰数目没有明显变化，故选30min为最佳提取时间。

2.2 重现性、精密度和稳定性

美味牛肝菌氯仿提取液紫外光谱的重现性变异系数在0.03%-0.63%之间：精密度变异系数在0～2.87%之间：10h内稳定性的变异系数在0.04%～1.73%之间，表明该方法稳定可靠。

2.3 美味牛肝菌菌盖、菌柄的紫外指纹图谱

由不同产地美味牛肝菌菌盖的紫外指纹图谱（图3）可见，不同产地美味牛肝菌菌盖主要紫外吸收峰出现的位置基本一致，所有样品在276、281、295nm等处出现明显的吸收峰，表明不同产地美味牛肝菌菌盖中化学组分基本相同：但不同产地美味牛肝菌菌盖的吸光度有很大差异，如在281nm处样品1的吸光度最小，为0.476，样品5的吸光度最大，为1.105，表明不同产地美味牛肝菌菌盖中化学成分量有差异。由不同产地美味牛肝菌菌柄的紫外指纹图谱（图4）可见，不同产地美味牛肝菌菌柄的紫外指纹图谱与菌盖紫外指纹图谱相似，峰形差异较小。而峰高（吸光度）差异较大：表明不同产地美味牛肝菌菌柄的化学组分差异不明显，而各成分含量不同。

2.4聚类分析

聚类分析是根据样品间的相似关系，将相似性大的样品聚为一类。从不同产地美味牛肝菌菌盖聚类分析的的树形图（图5）可看出7个不同产地样品聚为2大类，样品1、3、6间的距离及样品2、4、5间的距离小于5分别聚为一类，表明样品1、3、6之间及样品2、4、5之间的化学组分及含量差异较小；而这两大类样品间的距离较大，表明两类样品的化学成分含量差异较大。样品7与样品2、4、5聚成一类，表明样品7与样品2、4、5的差异较小。根据样品来源信息（表1）可知，距离小于5时能聚在一起的样品1、3、6均采自楚雄南华县，2和4采自具有部分接壤的晋宁县和易门县：距离小于10能聚在一起的样品5和7均采自姚安地区，表明美味牛肝菌积累的化学成分及含量与生长环境密切相关。

从不同产地美味牛肝菌菌柄聚类分析的树形图（图6）可看出，样品间距离小于5的7个不同产地样品聚为2类，第一类包括样品1、3、6，第二类包括样品2、4、5、7，两类样品间的距离较大，表明两类样品间的化学组分含量差异较大。与图5相比，菌盖和菌柄均能聚为两大类，但是聚类过程存在差异，表明美味牛肝菌不同部位对营养物质的富集能力不同。

3 结论

不同产地美味牛肝菌菌盖和菌柄的紫外光谱共有峰反映出不同产地美味牛肝菌主要的化学组分相似，而吸光度的差异反映了不同产地美味牛肝菌对化学成分的积累不同，这与Falandysz等研究的不同产地美味牛肝菌对矿质元素积累不同的结论相符。聚类分析结果显示采自地理位置较近区域的样品能聚在一起，表明美味牛肝菌的不同成分量与其生长环境有关，即土壤环境、气候条件等比较相似的地区美味牛肝菌化学成分积累较相似，而地质地貌、土壤环境、气候条件等差异较大的地区化学组分和含量差异较大。

应用紫外光谱法测定了7个不同产地美味牛肝菌菌盖、菌柄的紫外指纹图谱，样品紫外图谱出峰位置较相似，表明不同产地美味牛肝菌化学组分相似：而紫外吸光度大小具有一定的差异，表明不同产地美味牛肝菌化学成分含量不同。菌盖、菌柄紫外光谱数据转置后进行聚类分析，同一产地样品聚类效果较好，可以根据美味牛肝菌不同部位（菌盖、菌柄）的紫外指纹图谱结合聚类分析方法快速区分不同产地的美味牛肝菌。本研究为野生食用菌的鉴别分类提供新思路。