柴达木盆地梭梭LEA基因的扩增及序列分析

马玉花　冶贵生　冯志鹏

摘要：为发掘梭梭（Haloxylonammodendron）抗逆相关基因，以柴达木盆地梭梭的同化枝为材料，扩增其LEA基因并进行了序列测定与分析。结果表明，所得柴达木盆地梭梭的LEA基因碱基数为234bp，其中A碱基70个，T碱基52个，G碱基59个，C碱基53个；氨基酸序列分析表明，所得LEA基因片段编码78个氨基酸，其中强碱性氨基酸有12个，强酸性氨基酸有6个，疏水性氨基酸有34个，亲水性氨基酸有26个。

关键词：梭梭（Haloxyolonammodendron）；LEA基因；扩增；序列分析

中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2383-03

梭梭（Haloxylonammodendron）为藜科（Chenopo-diaceae）梭梭属（Haloxylon Bunge）多年生小乔木。主要分布在中国新疆、青海、内蒙古、甘肃的半荒漠和荒漠地区。柴达木盆地气候高寒干燥，蒸发量大降水量小，盆地沙漠化和盐渍化严重。梭梭作为柴达木盆地早生、盐生荒漠植被的主体，长期生长于干旱、盐碱的环境中，具有很强的抗旱、耐盐碱性，因而梭梭响应干旱、盐等非生物胁迫的生理生化机制研究备受重视。胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）是在棉花胚胎发育后期的子叶中大量累积的一类蛋白质，因而被称为胚胎发育晚期丰富蛋白，现已证明LEA蛋白不仅广泛存在于植物中，也存在于细菌和无脊椎动物中，Dure等根据氨基酸序列或亲水性结合每个LEA家族特有的保守序列，将LEA蛋白划分为6个家族，Battaglia等后来依据棉花中已获得的LEA蛋白氨基酸序列的同源性将LEA蛋白分为七类。大量的研究表明，LEA参与了植物对干旱、盐、低温等环境胁迫的响应，LEA蛋白可被各种胁迫条件诱导而大量产生，在植物脱水耐受中发挥重要作用。目前，有关梭梭LEA基因的研究鲜见报道。本试验对柴达木盆地梭梭进行LEA基因克隆的基础上，下一步对LEA基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析，以期为LEA基因的表达特性及功能研究奠定基础。

1 材料与方法

供试梭梭的种子采自青海省柴达木盆地，实验室育苗后取同化枝进行总RNA的提取。RNA提取试剂盒为北京艾德来生物技术有限公司产品，Ex-TaqDNA聚合酶、反转录酶、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

参照试剂盒说明提取梭梭总RNA，根据已发表的LEA基因序列设计扩增引物，由大连宝生物工程有限公司合成，预期目的片段长度为234bp。引物为LEA-F（5'-ATGGCTCGCTCTATCTCTAACG-3）、LEA-R（5-AGCCGCATGATFAGCAGG-3）。RT-PCR过程为取梭梭总RNA5μL，NHX-R4μL，DNTP Mixture3μL，RNase-FreeddH₂O3μL，70℃预热5min，立即冰浴2min，加入5倍的反转录缓冲液4μL，反转录酶1μL，置于42℃水浴50min，95℃5min，补加RNase-FreeddH₂O至总体积为50μL。PCR扩增程序：94℃1min，55℃1min。72℃1min，35个循环，72℃10min。将扩增正确的PCR产物送交生物公司进行序列测定，应用DNASTAR软件对LEA基因序列进行分析，用Blast程序进行序列同源性分析。

2 结果与分析

2.1 梭梭总RNA提取

提取的梭梭总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测表明（图1），RNA所在泳道28S和18S条带清晰，28S为18S的两倍，总RNA质量可以满足后续试验的要求。

2.2 梭梭LEA基因PCR扩增结果

将LEA基因的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明（图2）LEA基因所在泳道出现目的条带。大小与预期的234bD长度相符。

2.3 LEA基因核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3.1 核苷酸序列和氨基酸序列分析

梭梭LEA基因核苷酸序列经DNASTAR软件分析后，结果表明（表1、表2），LEA基因核苷酸序列长度为234bp，整个基因序列中A+T的含量高于G+C的含量，氨基酸序列长度为78aa，分子量为8301.34Da，等电点为10.15。各类氨基酸中碱性和酸性氨基酸的含量分别为15.4%和7.7%，疏水性和亲水性氨基酸的含量分别为43.6%和33.3%。

2.3.2 梭梭LEA基因与参考基因核苷酸序列和氨基酸序列比较 将获得的梭梭LEA基因与Genebank中登录的梭梭（Haloxylon aammodendron，JQ277729.1）、海马齿（Sesuvium portulacastrum，HQ427488.1）、甜菜（Beta vulgaris subsp，Vulgaris，LOC104898925）、长叶红沙（Reaumuria trigyna，KC701476.1）、茶（Camellia sinensis，JN400595.1）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana，AK228151.1）、可可（Theobroma cacao，XM007050896.1）、胡杨（Populuseuphratica，XM011011893.1）、荷花（Nelumbo nu-cifera，XM010261212.1）、橙子（Citrus sinensis，NM001289140.1）、黄瓜（Cucumis sativus，XM004165868.1）、牧豆（Prosopis juliflora，D0645423.1）等植物的LEA基因核苷酸序列与氨基酸序列进行同源性比较。结果表明（图3、图4），所得梭梭LEA基因序列与非梭梭属植物LEA基因序列间存在着丰富的变异，其核苷酸序列的同源性在48.3%-79.3%之间，氨基酸序列同源性在34.6%～75.7%之间，而与已登录的梭梭LEA基因核苷酸序列同源性为99.6%，氨基酸序列同源性为100.0%，说明梭梭LEA基因核苷酸序列的变异因密码子的简并性而属同义突变。

3 小结与讨论

胚胎发生晚期丰富蛋白（LEA）是当前逆境生理学研究的热点之一，前人的研究表明，在逆境胁迫下，胚胎发生晚期丰富蛋白大量积累并提高了植物的抗性，说明LEA蛋白积累是植物对环境适应的重要表现，LEA蛋白与植物抗逆性密切相关。本试验通过对柴达木旱生、盐生植物梭梭的LEA基因的克隆、序列分析及结构预测，将为柴达木盆地梭梭抗逆机理的阐明奠定基础。

本试验获得的柴达木盆地梭梭LEA基因总长234bp，编码78个氨基酸，序列比对分析表明柴达木盆地梭梭LEA基因核苷酸序列与不同科属植物LEA基因的同源性在48.3%-79.3%之间：氨基酸序列同源性在34.6%-75.7%之间，而与已发表的内蒙古巴丹吉林沙漠梭梭LEA基因的核苷酸序列存在一定的差异性，其同源性为99.6%，氨基酸序列同源性为100.0%，可见不同地域和自然环境的梭梭虽然其核苷酸序列上有一定的变异，但其氨基酸序列相同，未发生突变，这既保证了不同环境下梭梭LEA基因的一定程度的变异，也保证了NHX蛋白结构的稳定和功能的正常发挥。