Tae-miR9677小串联模拟靶标(STTM)表达载体构建及小麦的遗传转化研究

李赵杰，简 超，刘香利，赵惠贤

(西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵 712100)



Tae-miR9677小串联模拟靶标(STTM)表达载体构建及小麦的遗传转化研究

李赵杰，简 超，刘香利，赵惠贤

(西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵 712100)

摘要：小串联模拟靶标(Short tandem target mimic,STTM)技术是一种新开发的miRNA功能研究方法。 Tae-miR9677作为一种新发现的在小麦穗部特异性高表达的miRNA，其功能至今未知。为了进一步探索 Tae-miR9677的功能，构建了Ubiqutin(UBI)启动子启动的 Tae-miR9677 STTM过表达载体，并通过基因枪介导法对小麦品种绵阳19幼胚愈伤组织进行转化。结果表明，3 683个愈伤组织经过PPT(Phosphinothricin)筛选，最终分化获得42株再生植株；利用特异性引物进行PCR检测，鉴定出8株T0代阳性植株。

关键词：Tae-miR9677；小串联模拟靶标(STTM)；小麦；载体构建；转基因

目前，大量研究发现，miRNA在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等各种生物学过程中发挥重要的调节作用。小麦中已鉴定出大量miRNA，对这些miRNA的功能进行研究，将对小麦遗传育种改良有重大的生物学意义[1]。

通过抑制目的基因的表达来进行植物基因功能研究是功能基因研究重要策略之一。近年来，miRNA模拟靶标(Target mimicry，TM)的发现揭示了一种全新的miRNA沉默调控机制，并在miRNA功能研究中得到广泛应用[2-3]。Yan等[4]在miRNA 模拟靶标的基础上，创新出一种更加高效的沉默miRNA的新方法-小串联模拟靶标(Short tandem target mimic,STTM)。STTM由2个TM和一段48 nt起连接作用的特定序列组成，2个TM在其miRNA切割位点处都额外增加3个碱基，形成一个凸起结构，这一结构使其可以结合miRNA但不会被其切割。与传统TM技术构建的突变体相比，STTM突变体的表型更加明显，对miRNA的抑制效果更加显著[4]。利用过表达STTM转基因植株研究miRNA功能，已在拟南芥[5]、水稻[6]和陆地棉[7]等多种植物中得以实现，但在小麦中尚未见报道。

本实验室韩 冉等[8]通过对小麦品种小偃16的幼苗、旗叶和花后5、10及20 d籽粒的sRNA库进行深度测序，发掘出55个新的miRNA并提交至miRbase数据库。本研究在此研究的基础上，以在小麦穗部特异性高表达的 Tae-miR9677为研究对象，人工合成 Tae-miR9677的小串联模拟靶标序列，并将其构建到植物表达载体pCAMBIA3301上，采用基因枪转化法将该表达载体转入小麦中，旨在获得转基因小麦株系，用以探索利用miRNA小串联模拟靶标技术研究小麦miRNA功能的可行性。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1植物材料

转基因小麦受体绵阳19播种于西北农林科技大学农作一站试验田，于花后12～14 d采幼胚培养。

1.1.2载体与试剂

载体pCAMBIA3301和pTCK303(含UBI启动子)均由本实验室保存；pMD19-T载体、pUC57载体、TaqDNA聚合酶、质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒、TOP10感受态细胞、限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ和KpnⅠ等购自大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶PmlⅠ购自NEB公司；DNA markers Ⅲ、DNA markers 2000 plus购自康为世纪生物科技有限公司；引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.1.3培养基

诱导培养基：MS培养基+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂

高渗培养基：MS培养基+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+0.4 mol·L-1甘露醇分化筛选培养基：MS培养基+1 mg·L-1KT+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-1PPT+30 g·L-1蔗糖

生根培养基：1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA+15 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1琼脂

1.2 Tae-miR9677 STTM表达载体的构建

本研究设计的 Tae-miR9677 STTM序列由上海生工生物工程股份有限公司合成后，在该序列两端加上BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ限制性内切酶的酶切位点，然后将其连接到载体pUC57上。以载体质粒pTCK303为模板，用特异性引物UBI-F/UBI-R(UBI-F：5′-CTGCAGTGCAGC GTGACCC-3′; UBI-R:5′-CTGCAGAAGTAAC ACCAAAC-3′)进行扩增反应，获得UBI启动子片段，并通过TA克隆将其连接至载体pMD19-T上，获得重组载体pMD19-T-1。随后以含有 Tae-miR9677 STTM序列的载体pUC57为模板，用特异性引物STTM9677-F/STTM 9677-R(5′-GTTGTGTGGAATGTATGGAGC-3′; 5′-GCT GTAATCACACTGGCTCA-3′)扩增得到含有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ三个酶切位点的目的片段 Tae-miR9677 STTM，用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ同时双酶切pMD19-T-1和扩增得到的目的片段 Tae-miR9677 STTM，用T4连接酶将酶切得到的目的片段 Tae-miR9677 STTM连接至酶切后的pMD19-T-1上，获得含有UBI启动子和目的序列 Tae-miR9677 STTM的中间载体pMD19-T-2。对pMD19-T-2进行测序，确定UBI与目的序列连接正确无误后，用限制性内切酶HindⅢ和PmlⅠ对pMD19-T-2和植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，用UBI启动子+ Tae-miR9677 STTM片段替换掉表达载体pCAMBIA3301上的 CAMV35S启动子和GUS基因，以获得最终的转化载体pCAMBIA3301-STTM 9677。选取阳性克隆的重组质粒进行HindⅢ和PmlⅠ的双酶切检测，并进行测序，以鉴定构建的转基因表达载体的正确性。

1.3基因枪转化

小麦基因枪转化参照已报道的方法[9-11]。采集花后12～14 d的绵阳19未成熟种子，选取饱满的籽粒用70%乙醇表面消毒5 min，再用0.1%的升汞消毒15 min，无菌水冲洗5次。种子消毒后，取幼胚，盾片向上接种于诱导培养基中，置于24 ℃暗培养10 d，将幼胚的愈伤组织集中于高渗培养基的培养皿中央直径3 cm的范围内，高渗处理6 h后用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪进行轰击，金粉用量40 μg·枪-1，质粒pCAMBIA3301-STTM 9677用量1 μg·枪-1，氦气压力1 100 psi，轰击距离9 cm。轰击后的愈伤组织在高渗培养基上处理16 h后，将愈伤组织转移到诱导培养基，24 ℃暗培养1周。恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中，24～26 ℃光照培养10～12周，待愈伤组织分化小苗生长至苗高3～4 cm后转移到生根培养基中，待小苗根系发育充分后，移至4 ℃冰箱春化5周，将春化后的小苗移栽到花盆，在可控温室中培养。

1.4转基因小麦检测

待可控温室中生长的小麦苗长至三叶期，每株取1片叶，采用CTAB法提取基因组DNA。目的序列PCR检测所用引物9677STTM-F/9677STTM-R(9677STTM-F:5′-CAGGCTTTA CACTTTATGCTTCC-3′;9677STTM-R:5′-TGATAATCATCGCAAGACC-3′)是根据UBI启动子、 Tae-miRNA9677 STTM序列和两端酶切位点序列设计，预期扩增产物片段约2 164 bp。扩增体系总体积为20 μL，包含2×EsTaqMasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL(约700 ng)和ddH2O 7 μL。扩增程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经 1%琼脂糖EB凝胶电泳，紫外拍照。

2结果与分析

2.1表达载体的构建

按照方法1.2中描述的策略进行 Tae-miR9677 STTM表达载体的构建。构建过程中对每种重组质粒均进行菌落PCR检测或酶切鉴定。图1为利用pMD19-T通用引物对方法中介绍的重组质粒pMD19-T-2进行菌落PCR检测的结果。由图1可以看出，1～4泳道检测到的为UBI启动子+目的序列，片段大小为2 164 bp，与预期大小相符，表明其为连接成功的单克隆；而5泳道检测到的扩增片段，大小只有1 993 bp，比预期的小，说明其为未连接成功质粒。对重组质粒pCAMBIA3301-STTM 9677进行双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示。图2中1泳道为HindⅢ单酶切质粒结果，2泳道为HindⅢ与PmlⅠ双酶切结果，双酶切后得到的大小两个片段，大片段为载体骨架，小片段为2 164 bp的目的片段，这表明目的片段已成功连接至pCAMBIA3301载体上。进一步将得到阳性克隆送样测序，测序结果正确，表明 Tae-miR9677 STTM表达载体pCAMBIA3301-STTM 9677构建成功，可用于下一步基因枪转化实验。

M：DNA marker Ⅲ；1～4：阳性单克隆；5：阴性单克隆

M:DNA markerⅢ; 1-4:Positive clones; 5:Negative clone

图1重组中间载体pMD19-T-2菌落PCR检测结果

Fig.1Colony-PCR detection of middle vector pMD19-T-2

M：DNA markerⅢ；1：重组载体HindⅢ单酶切检测；2：重组载体HindⅢ+PmlⅠ双酶切检测

M:DNA markerⅢ; 1:HindⅢ single enzyme detection of recombinant vector; 2:HindⅢ+PmlⅠdouble enzyme detection of recombinant vector

图2重组载体酶切检测结果

Fig.2Enzyme detection of recombinant vector

2.2转基因植株的获得

接种小麦绵阳19幼胚4 000个，在诱导培养基培养10 d后，获得愈伤组织3 683个，愈伤诱导率为92.07%。以获得的愈伤组织为受体材料，用pCAMBIA3301-STTM 9677质粒基因枪转化，经过PPT筛选和诱导分化，共获得再生植株47株，其各阶段培养生长状况如图3所示，移栽至温室中存活42株。

2.3转基因植株的PCR检测

A:诱导的幼胚愈伤组织；B:筛选分化；C:再生苗；D:移栽至花盆的再生苗

A:Callus induced from immature embryo; B:Resistance selection and differentiation; C:Regenerated transgenic plants:D:Transgenic plants grown in pot

图3绵阳19转 Tae-miR9677 STTM的再生植株

Fig.3 Transgenic plants of Mianyang 19 with Tae-miR9677 STTM

将获得的转基因再生植株移栽至培养钵中于温室培养，取其幼嫩叶片提取基因组DNA，按顺序编号为1～42，并根据目的序列设计特异引物进行PCR检测。经多次PCR检测发现，阴性对照(非转基因的绵阳19植株)和空白对照(ddH2O)均没有扩增产物，阳性植株与质粒的扩增产物大小一致，均为2 164 bp大小的目的片段(图4)。42株再生植株中共有8株为转基因阳性植株，转化率为0.21%(图4)。

M：DNA marker III；7、13、26、28、32、35、38和42：转基因阳性植株；Y：阴性对照；S：ddH2O；Z：质粒

M:DNA marker III; 7,13,26,28,32,35,38 and 42:Positive transgenic plants; Y:Negative control; S:ddH2O; Z:Plasmid

图4T0代再生植株特异引物PCR检测结果

Fig.4PCR assay of regenerated T0plants

3讨 论

近年来，miRNA的TM开发为研究miRNA及调控靶标的功能提供了一种有效的方法。该技术是通过miRNA的沉默来揭示一种全新的调控机制[12-20]。Yan等[3]在拟南芥中转基因过表达 miR165/166-STTM，对 miRNA165/166家族的功能进行有效抑制，结果发现，该转基因突变体植株矮小、弯曲、叶片不规则；并且通过与传统转 miR165/166-TM的突变体相比，转 miRNA165/166-STTM突变体的表型更加明显。2014年，Gu等[6]将 miRNA165/166-STTM导入陆地棉，导致 miRNA165/166的靶标mRNAs显著增多，从而导致转基因棉花叶片折皱并向下弯曲，说明 miRNA165/166-STTM有效沉默了 miRNA165/166，解除了 miRNA165/166对其靶标的抑制。方瑞秋等[5]在水稻中通过农杆菌转化法获得转STTM 1428e-3p/1428a-3p-1的转基因水稻，观察发现其有效分蘖数减少，谷穗变大，花粉育性及结实率下降等一系列现象，初步揭示了 miR1428e-3p/1428a-3p-1的生物学作用。

小麦作为重要的粮食作物，揭示其生长发育过程中miRNA的调控作用十分重要。但是，目前小麦miRNA的研究工作大多还停留在miRNA的鉴定和发掘上[21-23]。关于miRNA功能的研究鲜有报道，其主要原因可能是缺乏有效的小麦miRNA功能研究方法。上述在其他物种中建立的通过转miRNA-STTM的技术来研究目标miRNA功能的方法为小麦miRNA功能研究提供了借鉴。据此，本研究以本实验室前期研究发现的小麦穗部特异性高表达 Tae-miRNA 9677为研究对象，利用基因枪转化法，将以UBI启动子启动的 Tae-miR9677 STTM序列导入小麦品种绵阳19之中；对获得的42个再生植株经过多次重复目标序列特异PCR鉴定，获得了8个转基因T0代阳性植株。这几个植株已经开花结实，有待收获。但是，目标序列是否插入并整合进受体小麦基因组上，还有待对此转基因植株后代进行追踪检测。如果后代植株中确有目标序列整合进基因组中，并能稳定表达的转基因阳性株系，这些阳性株系后续将可用于分析其中 Tae-miR9677及其调控靶标的水平变化，揭示 Tae-miR9677的功能研究。

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Construction of Expression Vector of Tae-miR9677 Short Tandem Target Mimic (STTM) and Transformation in Wheat

LI Zhaojie,JIAN Chao,LIU Xiangli,ZHAO Huixian

(College of Life Science,Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Short tandem target mimic (STTM) is an important method for miRNA function research. Tae-miR9677 is a newly discovered miRNA with high expression level in wheat spike,and its function has not been revealed. Therefore,it is very important to explore the function of Tae-miR9677 using STTM technology. In this investigation,the plant expression vector of Tae-miR9677 STTM controlled under Ubiqutin promoter was constructed. Then,3 683 immature embryos of Mianyang 19 were transformed using this vector by biolistic particle. After phosphinothricin selection and regeneration,42 regenerated plants were obtained,and of which eight were identified to be positive transgenic plants with Bar and Tae-miR9677 genes by PCR analysis.

Key words:Tae-miR9677; Short tandem target mimic (STTM);Wheat;Construction of expression vector;Transformation

中图分类号：S512.1；S330

文献标识码：A

文章编号：1009-1041(2016)04-0404-05

通讯作者：赵惠贤(E-mail:hxzhao212@nwsuaf.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金项目(31471482，31101205)

收稿日期：2015-12-11修回日期：2016-02-15

网络出版时间：2016-04-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1529.004.html

第一作者E-mail：zhaojieli1991@163.com