诺斯卡品对脑胶质瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用的实验研究

摘 要：目的：研究诺斯卡品对人脑胶质瘤细胞U87-MG的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法：用不同浓度诺斯卡品作用于人脑胶质瘤细胞系U87-MG 24，.48小时，观察形态学和分子生物学特性的改变。结果：诺斯卡品可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖并促进凋亡。结论：诺斯卡品可以尝试作为胶质瘤病人治疗的新型化疗药物。

关键词：胶质瘤细胞；凋亡；Caspase；bcl-2

胶质瘤（Glioma）是神经系统最常见的原发恶性肿瘤，传统治疗主要包括肿瘤切除和放射治疗。但由于肿瘤侵袭性极强，术后复发率极高。

诺斯卡品多年来一直作为镇咳药物使用，近年来抗肿瘤药物实验研究发现诺斯卡品及其衍生物具有抗癌活性，通过作用于微管，使肿瘤细胞长期处于静止期，从而影响有丝分裂达到抑制增殖的目的。

体外及体内实验均表明诺斯卡品能够明显抑制乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖和周围血管生成，并诱导其凋亡。更为重要的是，在多种小鼠肿瘤模型中，它对心、肾和肝脏等重要脏器无毒性或仅有轻微毒性。目前研究发现诺斯卡品诱导凋亡的机制主要与caspase家族级联反应、线粒体途径、以及Bcl-2家族成员相关。

本研究拟通过诺斯卡品作用于人胶质瘤细胞U87-MG，观察其增殖抑制和诱导凋亡的作用，并探讨其可能的机制。

1 方法

用诺斯卡品（50，100μmol/L）作用于人脑胶质瘤细胞系U87-MG 24，.48小时，显微镜下观察细胞形态及生物学特性的改变。利用细胞增殖抑制试验（MTT方法）观察不同浓度诺斯卡品对细胞活性的影响；流式细胞仪检测细胞生长周期变化；蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测经诺斯卡品处理后Bcl-2，及Bax，等相关凋亡因子蛋白表达水平的变化。

所有数据用均数±标准差（mean±S.D.）表示。所有数据在SPSS13.0软件包上处理。采用非独立样本t检验， Spearman等级相关分析。P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 实验选择合适的诺斯卡品作用浓度

我们选择了5个浓度梯度的诺斯卡品（25，50，100，200，

400μmol/L）作用于U87-MG细胞24h，48h，72h。结果发现诺斯卡品对U87-MG细胞具有明显的抑制作用。浓度为50μmol/L的诺斯卡品24，48，72h后抑制率相近，在20%左右。浓度为400μmol/L的诺斯卡品24h.，48h，72h后，细胞的增殖抑制率相近，在85%左右。浓度为100μmol/L的诺斯卡品24h.，48h，72h后，抑制率在50%左右。

2.2 倒置显微镜观察诺斯卡品对细胞形态的影响

用浓度为100μmol/L诺斯卡品作用于U87-MG细胞48h后，可见到培养基内部分细胞呈不完全贴壁生长状态，贴壁的细胞间连接减少、存在细胞碎片。对照组的细胞则贴壁生长，连接紧密，突触多，核分裂象多见。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期变化

U87-MG细胞经过诺斯卡品100μmol/L处理24h，48h后，收集所有漂浮和贴壁的细胞，用流式细胞仪检测，诺斯卡品抑制U87-MG细胞于M期，表明诺斯卡品诱导的增殖抑制作用和细胞周期阻滞相关。

2.4 诺斯卡品通过caspase家族级联反应诱导U87-MG细胞凋亡

Caspase家族在细胞凋亡过程中是执行凋亡的主要酶类，实验结果发现，诺斯卡品作用于U87-MG细胞24，48h后，可检测到Caspase-3的激活以及PARP的裂解。

众所周知，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax通过线粒体介导的凋亡途中在多种人类肿瘤的形成及发展中起重要作用。诺斯卡品作用于U87-MG后可以检测到Bcl-2蛋白的表达下降，但本实验未检测到Bax蛋白的表达有明显变化（P<0.05）。

3 讨论

诺斯卡品作为围观抑制剂可以使微管长时间的处于静止期，但细胞内微管蛋白的总量保持不变。这可能是动物模型实验中诺斯卡品对重要脏器无明显毒副作用的原因。诺斯卡品对肿瘤细胞的选择性杀伤作用可能是由于肿瘤细胞存在纺锤体作用点机制的缺陷。

MTT结果表明诺斯卡品作用后，胶质瘤细胞U87-MG生长受到了明显的抑制，且药物浓度、作用时间与细胞活性呈较好的线性关系。

大量研究表明，caspase家族级联反应参与了细胞凋亡的作用机制。活化的Caspase通过特异性裂解底物导致细胞凋亡，分为凋亡起始因子Caspase-2，8，9和凋亡执行因子Caspase-3，6，7（15）。细胞凋亡开始后，起始因子激活执行因子，最终激活Caspase-3，导致PARP蛋白的剪切。诺斯卡品作用于人脑胶质瘤U87-MG细胞后，实验检测到了Caspase-3的激活和PARP的剪切。

Bcl-2作为重要的抗凋亡基因，在诺斯卡品作用组和对照组中表达量的明显差异说明可能是通过控制抗凋亡因子Bcl-2的表达来调控细胞的增殖和存活。使用诺斯卡品作用后Bcl-2蛋白的表达明显下调，而Bax蛋白的表达基本无变化。说明诺斯卡品是通过通过作用于Bcl-2因子使其蛋白水平得以相应降低并促进了肿瘤细胞的凋亡。

4 结论

本实验研究结果表明在体外实验中诺斯卡品可以明显抑胶质瘤细胞U87-MG的增殖并促进其凋亡，其过程可能有多条信号通路共同调控，有待进一步的研究证实。

参考文献：

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[2] Yek，Key，Keshava N，et a1.Opium alkaloid noscapine is an antitumor agent that arrests metaphase and induces apoptosis dividing cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（4）：1601-1606.

作者简介：范菁（1984-），女，浙江杭州人，神经肿瘤。