橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

贺永国 李哲 黄绵佳 曾宪海 林位夫 刘洁琼 张春红 马晓晓

摘要：【目的】克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1（PHEV2.1），构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因（HbHMGR1）的乳管特异性植物表达载体，为橡胶树遗传转化奠定基础。【方法】根据已报道的HEV2.1序列（GenBank登录号AY247789.1）设计1对特异引物，采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1，与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体，并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定。【结果】用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852 bp的PHEV2.1片段，其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%。将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1，经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功。【结论】将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上，能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现Pst I突变、阻碍载体构建的难题，成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1。

关键词： 橡胶树；乳管特异性启动子PHEV2.1；HbHMGR1基因；植物表达载体；构建；鉴定

中图分类号： S794.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0163-06

0 引言

【研究意义】转录水平调控是基因表达调控的主要环节，对植物启动子功能进行研究不仅可以揭示相应基因的表达模式，还能为利用植物基因工程技术实现基因的高效特异性表达提供有效途径。橡胶蛋白（Hevein）是胶乳的主要成分，可在乳管中高效表达，占可溶性蛋白质的50%～70%，其基因家族成员HEV2.1基因启动子是乳管特异表达的强启动子（Van Parijs et al.，1991；Montoro et al.，2008）。橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1（HbHMGR1）是橡胶生物合成途径的关键限速酶（Lynen，1969；……