穴位埋线联合盐酸甲氯芬酯对血管性痴呆大鼠海马CA1区几种重要蛋白质表达的影响

杨　琼　戴桃李　陈　粲　潘　娅

(贵州民族大学民族医药学院，贵州　贵阳　550025)



穴位埋线联合盐酸甲氯芬酯对血管性痴呆大鼠海马CA1区几种重要蛋白质表达的影响

杨琼戴桃李1陈粲2潘娅2

(贵州民族大学民族医药学院，贵州贵阳550025)

〔摘要〕目的探讨穴位埋线与盐酸甲氯芬酯联合治疗血管性痴呆(VD)大鼠的神经生化机制。方法改良四血管阻断法建立VD大鼠模型；造模后分3个治疗组，分别为盐酸甲氯芬酯治疗组、“肾俞” 、“足三里”穴位埋线治疗组(埋线组)及盐酸甲氯芬酯联合穴位埋线组(联合组)；免疫组织化学SABC法检测并比较各组大鼠海马CA1区内三种重要蛋白质的表达情况：胆碱乙酰转移酶(ChAT)、脑源性神经营养因子(BDNF)及半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。结果经联合治疗后，大鼠海马CA1区ChAT、BDNF免疫反应阳性神经元数目明显增多，Caspase-3阳性神经元数目明显减少，各项指标与单独治疗组相比，差异明显(P<0.05，P<0.01)。结论盐酸甲氯芬酯联合穴位埋线治疗法，对VD大鼠海马胆碱能神经元具有良好的保护作用，这可能与其上调海马BDNF及下调Caspase-3密切相关。

〔关键词〕盐酸甲氯芬酯；穴位埋线；血管性痴呆；胆碱乙酰转移酶；脑源性神经营养因子；半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶

目前血管性痴呆(VD)尚无特效治疗方法。盐酸甲氯芬酯是中枢兴奋药，临床上主要用于脑外伤昏迷、脑卒中、小儿遗尿、精神错乱等的治疗，这与其具有抗缺血、缺氧等作用有关〔1〕。中医疗法具有操作简单、无毒副作用、标本兼治的优势〔2〕。本研究采用盐酸甲氯芬酯联合“肾俞”、“足三里”穴位埋线方法进行治疗，并检测VD大鼠脑内与学习记忆功能密切相关的脑区——海马处胆碱乙酰转移酶(ChAT)、脑源性神经营养因子(BDNF)及半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)三种重要蛋白质的表达水平，探讨盐酸甲氯芬酯联合“肾俞”、“足三里”穴位埋线联合应用对VD模型大鼠的影响及其机制。

1材料与方法

1.1动物及试剂5～6月龄健康雄性SD大鼠75只，体重280～300 g，清洁级，由贵阳医学院动物中心提供。盐酸甲氯芬酯胶囊(广东先强药业有限公司)。ChAT 试剂盒、BDNF试剂盒、Caspase-3试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型制备大鼠随机平均分五组：假手术组、模型组、盐酸甲氯芬酯治疗组(甲氯芬酯组)、“肾俞”、“足三里”穴位埋线治疗组(埋线组)、盐酸甲氯芬酯及穴位埋线联合治疗组(联合组)。采用改良Pulsinelli四血管阻断 (4-VO) 法建立VD大鼠模型：模型组和治疗组大鼠经10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉后，行背侧颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔，用电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞；再将大鼠行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用；24 h后用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，5 min×3次，每次间隔1 h。假手术组处理步骤同上，但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。模型制作成功检验：大鼠在4条血管阻断后，翻正反射消失，虹膜变白及瞳孔散大。不符合标准者剔除。

1.2.2治疗方法甲氯芬酯组和联合组用盐酸甲氯芬酯(100 mg·kg-1·d-1)溶于2 ml水中灌胃；假手术组、模型组和埋线组给予相同体积的蒸馏水灌胃。同时埋线组和联合组按照图谱定位〔3〕，在双侧“肾俞”穴、“足三里”穴常规消毒后，用8号注射针头埋入0.5 cm长的(4～0)医用羊肠线。整个治疗连续4 w。未满4 w中途死亡者被剔除。

1.2.3免疫组化染色麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理盐水和10%中性甲醛以固定鼠脑，经脱水、透明、石蜡包埋处理后，行鼠脑海马冠状位切片，片厚4～5 μm。每只大鼠每个指标切5张片。免疫组织化学SABC法检测海马CA1区ChAT、BDNF、Caspase-3的表达，操作严格按照说明书进行。每张切片取5个视野，每个视野采集一幅图像，计数ChAT、 BDNF、Caspase-3免疫反应阳性细胞数，取其平均值作为最后结果。

1.3统计学处理应用SPSS15.0软件进行单因素方差分析及S-N-K检验。

2结果

2.1海马CA1区ChAT的表达ChAT免疫反应阳性细胞在镜下可见胞质有棕黄色阳性物质。假手术组海马CA1区有大量ChAT阳性神经细胞分布，且胞质内有大量棕黄色阳性物质。模型组海马CA1区细胞严重脱失，细胞结构模糊，胞体固缩，染色较淡，ChAT阳性神经细胞数较假手术组明显减少(P<0.01)。3个治疗组阳性细胞数较模型组增多、细胞排列较规则，固缩细胞明显减少，ChAT阳性神经元均显著增多，其中以联合组的水平最高(P<0.01)。见表1。

2.2海马CA1区BDNF的表达假手术组海马CA1区有少量BDNF阳性细胞，免疫阳性颗粒主要分布在胞质和细胞膜表面。模型组海马CA1区BDNF阳性细胞数目较对照组明显增多(P<0.01)，胞质内棕黄色阳性颗粒密集深染。3个治疗组免疫反应阳性神经元数均较模型组显著增多，其中以联合组的水平最高(P<0.05)。见表1。

2.3海马CA1区Caspase-3的表达假手术组海马CA1区有极少量Caspase-3阳性细胞，其胞质内有棕黄色阳性物质。模型组海马细胞脱失，但Caspase-3阳性细胞数量增加，胞质内棕黄色物质增多，与假手术组比较差异显著(P<0.01)。3个治疗组Caspase-3阳性细胞数减少，其中以联合组的水平最低，与模型组比差异显著(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠海马CA1区ChAT、BDNF及Caspase-3阳性

与对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05，与联合组比较：4)P<0.01，5)P<0.01

3讨论

脑反复缺血再灌注损伤和长期慢性低灌流是VD的主要发病原因〔4〕。实验采用国际公认的改良Pulsinelli 4-VO法，永久性灼断椎动脉并可逆性阻断颈总动脉血流，使大鼠脑处于长期低灌流状态，致脑功能严重受损，制备出近似人类临床发病特点的VD大鼠模型〔5〕。

中医将VD归属于“中风”、“呆病”、“善忘”的范畴，认为肾虚髓空是VD的根本，心肾不足、肝肾脾虚、气血亏虚，则脑髓不足、神明失养而致痴呆〔6〕。“肾为先天之本，肾生髓”，“肾俞”穴有益精血、补脑髓，畅活气血的作用〔6,7〕；“足三里”穴属足阳明胃经，为气血生化之源〔7〕。穴位埋线法是在祖国传统针刺法思路上发展的另一技术。肠线作为一种异质蛋白，埋入穴位后有持久、柔和的穴位刺激优势；同时羊肠线逐渐被机体吸收，能调节机体内环境的相对平衡，改善病灶部位血液循环，增加大脑营养供应〔8〕。

海马作为边缘系统的组成部分，是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢。记忆突触就是胆碱能突触，是学习记忆的结构和生理基础〔9〕。海马对缺血缺氧极为敏感。当胆碱能神经元受损时，脑内学习记忆的神经生物学基础—海马环路就会受损，导致痴呆发生。乙酰胆碱是迄今发现与学习记忆关系极为密切的一种神经递质〔10〕。 ChAT常作为研究胆碱能神经元的标志或评估乙酰胆碱含量的间接指标〔11〕。本实验结果提示此方法具有良好的保护缺血缺氧状态下的海马胆碱能神经元的作用。

BDNF是神经营养家族重要成员之一，广泛分布于神经系统。它在胚胎生长发育过程中水平较高，随着机体发育成熟其水平逐渐降低，在缺血缺氧的情况下反应性增高，与脑缺血损伤的保护有关〔12〕，其高表达不仅能提高神经元抵抗缺血损伤的能力，还能促进受损神经元的修复，并调节神经结构的重建。本文结果表明BDNF表达增加是局部脑组织对缺血损伤的反应，而这一反应可能也启动了神经细胞修复机制；盐酸甲氯芬酯联合穴位埋线可以很好地加强这一保护机制，较单治疗组明显减轻了海马神经元缺血损伤。

海马结构中各功能亚区(CA1、CA2、CA3、CA4、齿状回)神经元的丢失可能是血管性痴呆形成的病理学基础，其中以CA1区大锥体细胞的丢失尤为重要〔13〕。而缺血缺氧所致的神经细胞丢失是以凋亡为主〔14〕。Caspase-3被认为是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，通常情况下Caspase酶原没有活性，必须通过激活，才能诱导凋亡。当机体缺血缺氧时，凋亡发生机制被激活，所有的Caspase家族成员都被剪切，上游Caspase有序地激活下游，将凋亡信号传至底物，而下游Caspase-3就是这个级联反应的终末执行酶。它能降解多种胞内蛋白，导致胞体固缩，染色体蹦解，凋亡小体形成〔15〕而发生细胞凋亡。本文结果表明细胞凋亡反应受到抑制，缺血缺氧所致细胞损伤减少。

综上所述，本课题采用中西医相结合的方法对VD进行治疗，观察到大鼠海马部位ChAT表达明显增多，这可能恰与其上调BDNF水平及下调Caspase-平有关。即BDNF提高了神经元抵抗缺血损伤的能力，Caspase-3下调减少了脑细胞凋亡的程度，二者协同作用，使缺血缺氧状态下神经元得到很好保护，降低了VD的脑损伤。

4参考文献

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15褚燕琦,李林.蛋白的磷酸化与病的神经元凋亡〔J〕.中国老年学杂志,2005；25(3):351-4.

〔2014-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：贵阳市科技局基金资助(No.T2006-12)

〔中图分类号〕R338.6

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)09-2076-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.012

1暨南大学医药生物技术研究开发中心

2贵州医科大学基础医学院生理学教研室

第一作者：杨琼(1980-)，女，硕士，讲师，主要从事神经生理学研究。