规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感疫苗免疫效果调查

汪招雄，欧阳金旭，杨玉莹，杨丰利，江 涛，陈雪娇

（1. 湖北省荆州市长江大学动物科学学院，荆州434023；2. 湖北省荆州市畜牧兽医局，荆州434020）



规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感疫苗免疫效果调查

汪招雄1，欧阳金旭2，杨玉莹1，杨丰利1，江 涛1，陈雪娇1

（1. 湖北省荆州市长江大学动物科学学院，荆州434023；2. 湖北省荆州市畜牧兽医局，荆州434020）

摘 要：为了解湖北省规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感疫苗的免疫效果，本研究在2014年1月至12月从湖北省13个地区选择不同规模化蛋鸡场，随机采集蛋鸡血样2189份，用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）试验测定了H9N2亚型禽流感抗体滴度。对样本检测结果进行统计与分析显示，1月份到5月份样本HI抗体滴度平均值呈上升趋势，1月份检测的样本抗体滴度最低，为9.26log2， 5月份检测的样本抗体滴度最高，为12.34log2。13个不同地区样本抗体滴度存在一定的差异，抗体滴度最低地区的平均值为5.76log2，滴度最高地区为11.58log2。对不同日龄蛋鸡样本检测结果分析显示，随着日龄增长，样本平均抗体滴度值呈现逐渐上升趋势，蛋鸡日龄≤120 d的样本抗体滴度平均值最低，为10.21log2，300日龄以上的蛋鸡样本抗体滴度平均值最高，为11.31log2。检测结果表明，湖北省规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感的平均抗体滴度值水平总体良好，合格率和优秀率较高，但不同地区、不同日龄和不同月份蛋鸡H9N2亚型禽流感抗体存在差异。

关键词：禽流感；H9N2亚型；蛋鸡场；免疫效果

禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的传染性疾病，该病毒属于正黏病毒科。A型流感病毒的血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）抗原容易变异，已知HA有18个亚型（Hl～H18系列），NA有11个亚型（N1～N11系列）[1,2]。H5N1亚型为高致病性禽流感病毒，引起疫情暴发而已经受到人们的重视，而H9N2亚型为低致病性禽流感病毒，但是因为它传播广泛，而且同样可引起人和动物致病，甚至引起疫病的暴发和流行，其危害不容忽视[3,4]。

H9N2亚型禽流感病毒从1994年开始被发现时，就已经在中国大陆的家禽中流行。该型病毒感染性强、传染范围广，本身结构不稳定具有变异性，不仅能给养禽业造成损失，也对人类和低等哺乳类动物直接构成威胁，具有重要的公共卫生学意义。H9N2亚型禽流感一年四季均可发生，但通常以冬季和春季较为严重。气候多变、突变，养殖密度过大，饲养管理不当，有害气体过多损害上呼吸道粘膜，都是本病发生的诱因。该型病毒主要引起蛋鸡呼吸道症状、产蛋率下降和蛋品质量下降[4,5]。

疫苗作为控制禽流感大流行的一种主要手段，受到各个国家的重视，几乎所有规模化蛋鸡场都进行了禽流感疫苗的预防接种。目前我国使用的疫苗毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株、Sy株、LG1株、L株、YBF003株、F株、S2株和NJ02株等毒株。但由于气候、管理和免疫程序、鸡群的品种、接种剂量及疫苗质量差异等原因，导致各鸡群禽流感抗体水平参差不齐[5,6]。本研究在不同时间对湖北省不同地区规模化蛋鸡场随机抽样，并对H9N2亚型禽流感抗体进行了检测。本研究的完成不仅可以了解湖北省不同地区规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感免疫抗体水平，还可以根据检测结果，指导养殖场制定合理的免疫程序，分析可能存在的原因，并提出相关防控措施建议，对防控H9N2禽流感的发生和流行具有十分重要的意义。

1　材料与方法

1.1材料 H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制试验标准抗原、阳性血清；0.85%生理盐水、红细胞保存液(PBS 液)、3.8%柠檬酸钠抗凝剂。

1.2方法

1.2.1血液采集及血清制备 对湖北省不同地区（安陆、公安、荆门、潜江、石首、松滋、天门、浠水、仙桃、襄阳、孝感、应城、枣阳）规模蛋鸡场随机采血，每只翅下静脉采血2 mL，共采集血液样本2189份。采集血样静置1 h，8000×g 离心 5 min，取上层血清待检。

1.2.21%红细胞悬液制备 用一次性注射器随机采取健康非免疫公鸡血液，放入加有抗凝剂的离心管中，抗凝剂与全血的比例约为1:2左右，迅速混匀。然后放入离心机中以 500×g 离心5 min，吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，再次在离心管中加生理盐水，慢慢混合均匀，500×g离心5 min，弃去上清液，按照上述方法反复操作4～5次，直到上清液澄清透明，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。吸取 0.1 mL红细胞泥，加入9.9 mL的生理盐水，即为 1% 红细胞悬液。

1.2.34单位抗原配制 取出冻干的浓缩抗原，加入2 mL生理盐水稀释融化后，测定抗原效价，能够完全引起血凝的病毒最高稀释度视作抗原的效价，此稀释度为1个 HA 单位抗原，以此稀释度配制4个 HA单位抗原。

1.2.4待检样品测定 根据血凝抑制试验的方法及操作规范对血清样品进行检测，设置阴性和阳性对照。

1.2.5结果判定 在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作45度倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清对其HI效价≥6log2时，判为抗体滴度合格；HI效价≥9log2时，判为抗体滴度优秀。

2　结果

2.1不同月份蛋鸡场样本H9N2亚型禽流感抗体效价分析 按照不同月份，对2014年1月至2014年12月2189份蛋鸡样本H9N2亚型禽流感抗体检测结果进行分析。2014年12个月样本H9N2亚型禽流感抗体滴度平均值较高，均超过9.01og2，2189份蛋鸡样本H9N2亚型禽流感HI抗体滴度平均值为10.771og2。其中5月份 H9N2亚型禽流感平均抗体滴度值最高，达到 12.341og2，1月份平均抗体滴度值最低为 9.261og2，并且1月份到5月份呈现持续上升的趋势。其他月份平均抗体滴度介于两者之间（见表1）。

表1 规模化蛋鸡场不同月份H9N2亚型禽流感抗体效价Table 1 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different month

对2014年12个月所有样本H9N2亚型禽流感抗体滴度进行了分类，所有月份血样中禽流感病毒H9N2亚型抗体抗体滴度合格率（HI≥6）均较高，最低的是1月份，为 97.4%，然后是4月份的为99.2%，3月的为99.7%，其他各月平均抗体滴度均为100%；优秀率（HI≥9）最低的是 1 月份，为 78.7%，而5、8、9月份的优秀率很好，达到100%（见表2）。

2.2不同地区蛋鸡场样本H9N2亚型禽流感抗体效价分析 对 13个不同地区样本H9N2禽流感抗体抗体滴度检测结果开展了分析。湖北省不同地区样本中，H9N2亚型禽流感抗体滴度平均值最低的来源于安陆，抗体效价平均仅为 5.761og2；抗体滴度最高的是来源于枣阳的蛋鸡样本，H9N2禽流感抗体效价平均为 11.581og2，其他各个地区蛋鸡血样的抗体效价平均值间于这二者之间。除了安陆、潜江和浠水蛋鸡样本外，其他各个地区的 H9N2 禽流感抗体效价平均滴度值均在 9.00log2 以上（见表3）。

各个地区采集来的血液样本中，来源于安陆血样中 H9N2 禽流感抗体合格率（HI≥6）最低，为52.0%，潜江的为75.0%，公安的为93.2%，仙桃的为99.8%，其他的血样抗体滴度合格率均为100%。安陆的血样H9N2抗体滴度优秀率（HI≥9）最低，仅为24.0%，优秀率最高的是来源于荆门检测样本，高达98.4%（见表4）。

2.3不同日龄蛋鸡场样本H9N2亚型禽流感抗体效价分析 对不同日龄蛋鸡样本 H9N2亚型禽流感抗体效价开展了分析。不同日龄蛋鸡血液样本H9N2亚型禽流感抗体滴度平均值都大于10，抗体滴度较高，日龄不高于120 d的蛋鸡样本 H9N2 禽流感抗平均滴度值最低，为10.47log2，随着日龄的不断上长，样本的 H9N2 禽流感抗平均滴度值不断上升，当蛋鸡日龄超过300 d时，抗体滴度达到11.31（见表5）。

表2 规模化蛋鸡场不同月份 H9N2亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 2 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different month

表3 规模化蛋鸡场不同地区 H9N2 亚型禽流感抗体效价Table 3 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different area

表4 规模化蛋鸡场不同地区 H9N2亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 4 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different area

表5 规模化蛋鸡场不同日龄蛋鸡 H9N2亚型禽流感抗体效价Table 5 The antibody titer of H9N2 subtype AIV from different layer farms

分析不同日龄蛋鸡样本合格率和优秀率可以发现，不同阶段蛋鸡的样本 H9N2 禽流感抗体合格率均在 85.0%以上，随着日龄的增加，合格率越高。而在蛋鸡日龄不高于 120 d时，H9N2禽流感抗体优秀率为 78.5%，日龄超过300 d H9N2禽流感抗体优秀率达到97.4%（见表6）。

3　讨论

历时一年对2014年湖北省13个蛋鸡养殖密集区（县、市）规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫抗体水平进行了检测，检测结果显示，在不同区域、不同日龄蛋鸡和不同月份，H9N2亚型禽流感HI抗体滴度平均值、合格率和优秀率均较高。2013年湖北省规模化蛋鸡场H9N2亚型禽流感HI抗体滴度平均值9.191og2，2014年抗体滴度进一步上升，达到了10.771og2，显示了H9N2亚型禽流感疫苗的免疫的良好效果，该抗体滴度可以保护蛋鸡群免受同型病毒的感染。取得如此良好的免疫效果，主要与养殖企业加强了防疫意识有直接的关系，特别是2013年我国爆发了高致病性禽流感，给蛋禽业造成较大的经济损失，养殖企业充分认识到防疫的作用，加强了对优质疫苗的选择，制定了合理的免疫程序，认真执行了防疫措施[5]。

表6 不同日龄蛋鸡 H9N2 亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 6 The pass and excellence rate of antibody titer of H9N2 subtype AIV from different layer farms

但是检测结果还显示，相对于其月份，1月份样本H9N2亚型禽流感HI抗体滴度平均值偏低，这可能与冬季来临，气温降低，鸡舍通风不畅，鸡群免疫力减低等因素有一定的关系。一方面天气寒冷会引起鸡体产生较强的应激反应，影响疫苗免疫效果，另一方面寒冷季节会造成部分养殖企业减低疫苗密度、延长H9N2疫苗免疫时间。冬季为禽流感多发季，鸡群会面临更大威胁，因此养殖企业要在冬季做好保温措施的同时，尽量降低蛋鸡群机体的免疫应激反应，严格执行科学的免疫程序，保证对鸡群H9N2亚型禽流感疫苗合理的免疫密度[5,6]。

在不同地区，蛋鸡在接种H9N2亚型禽流感疫苗后，抗体滴度平均值、合格率和优秀率存在一定的差异，部分地区免疫效果还有一定的提升空间。导致各地免疫效果存在差异现象的原因与各地的免疫程序和选择的疫苗有直接的关系。由于各个地方蛋鸡场养殖模式不一样，养殖场环境存在一定的差异，免疫程序、免疫途径、免疫剂量和所免疫的疫苗也存在差异，因此，抗体滴度较低地区可以参考其他蛋鸡养殖比较好的地区的管理经验和免疫程序（产蛋前免疫3次，产蛋后每间隔120 d加强免疫1次），同时结合最近几年病原流行的变化调整免疫程序，及时进行抗体监测，提高这些地区鸡群H9N2亚型禽流感抗体水平。

对不同日龄蛋鸡H9N2亚型禽流感抗体进行分析显示，在我们划分的四个阶段（青年鸡、初步进入产蛋高峰期、产蛋高峰期和产蛋下降期），H9N2亚型禽流感抗体水平滴度都较高，均超过了101og2，显示和不同阶段蛋鸡群H9灭活疫苗良好的免疫效果。但是在蛋鸡日龄不高于120 d和200 d两个阶段，部分鸡群抗体滴度值小于4log2，存在抗体滴度离散度大，整齐度不好的特点，这提示部分鸡场鸡群产生抗体的能力存在差异，是鸡只免疫抑制的原因、疫苗吸收不良的原因还是包含其他原因，值得进一步去研究。

免疫接种只是预防H9N2亚型禽流感的最有效方法之一。目前我国使用的H9N2疫苗毒株有HP株、WD株、SS/94株、HL株、SD696株等十几个毒株，疫苗的种类有单价灭活疫苗，二联灭活疫苗和三联灭活疫苗，如此多的选择增加了养殖企业防疫的困惑和难度。虽然蛋鸡场开展了较好的免疫工作，但是在临床上经常会发现H9感染蛋鸡的案例[7-10]，因此尽早开展H9禽流感分子流行病调查，调整疫苗的毒株，正确指导养殖企业开展科学的防疫显得尤为重要。

参考文献

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·研究论文·

FIELD EFFICANY OF H9 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VACCINE IN LAYING HENS IN HUBEI

WANG Zhao-xiong1, OUYANG Jin-xu2, YANG Yu-ying1, YANG Feng-li1, JIANG Tao1, CHEN Xue-jiao1

(1. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. Animal Husbandry Bureau of Jingzhou city, Jingzhou 434100, China)

Key words:Avian infl uenza; H9N2 subtype; layer farm; immune effect

Abstract:In order to investigate the immune effect of H9N2 subtype avian influenza vaccine on large-scale layer farms in Hubei province, 2189 blood samples were randomly collected from January to December 2014 from poultry farms in 13 regions. The antibody titers of H9N2 subtype Avian infl uenza virus were determined in hemagglutination inhibition test (HI). The results showed a rising trend of the average HI antibody titers from January to May. The antibody titers were the lowest (9.26log2) in January and the highest (12.34log2) in May. In addition, there were some differences between 13 different regions with the lowest antibody titer at 5.76log2 and the highest titer at 11.58log2. The results also showed that the average antibody titers increased gradually with the aging. The average antibody titer was the lowest at 10.21log2 when chicken were less than 120 days old while the average antibody titer was the highest at 11.31log2 when the hens were more than 300 days old. The investigation concluded that the antibody level of H9N2 subtype avian infl uenza vaccine was good in general good and the qualifi ed or excellent immune protection was relatively high on layer farms in Hubei province. However,some differences in the antibody titers of H9N2 subtype avian infl uenza vaccine were observed in different regions, ages and months of the year.

中图分类号：S852.659.5

文献标志码：A

文章编号：1674-6422（2016）01-0015-07

收稿日期：2015-11-17

基金项目：长江大学校基金

作者简介：汪招雄，男，讲师，博士，主要从事动物病毒致病机制研究

通信作者：汪招雄，E-mail：luke751751@163.com