拟南芥缺失突变体at14a的比较转录组分析

王琳+孙庆玲+刘辉+梁建生

摘要：以at14a相关基因型（野生、缺失）拟南芥植株为试验材料，利用转录组学和生物信息学等方法，分析野生型（col）、缺失突变体（at14a）拟南芥差异基因表达状况，初步探讨拟南芥AT14A的功能。结果表明：at14a在拟南芥植株根、茎、叶和花中均有表达，尤其在叶片中的表达量较高；相较于野生型，缺失突变体at14a中有194个差异基因，其中上调基因122个，下调基因72个；通过GO富集分析发现，2种基因型植株差异基因主要参与了应答胁迫过程，这表明at14a可能通过调控AT5G39610、AT1G53240、AT4G32770、AT1G02920、AT1G10760这些逆境胁迫相关基因的表达来参与应答胁迫。差异分子主要定位于细胞核，具有绑定的分子功能。通过pathway分析发现，2个基因型植株差异基因主要参与了核糖体代谢、碳水化合物代谢、光合等代谢途径。研究结果为深入研究at14a作用的分子机理奠定了基础。

关键词：AT14A；拟南芥；缺失突变体；基因芯片；转录组学

中图分类号：S188；Q786

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0070-04

植物细胞壁可能与膜蛋白相互作用，其中一类膜蛋白就是与动物细胞整合素蛋白相似的类整合素蛋白。整合素是动物细胞黏附分子的重要成员，属于一类跨膜蛋白的超家族，是由2个跨膜糖蛋白亚基（α、β）通过非共价键连接而成的异二聚体，它们黏附于细胞外基质（ECM）并结合细胞骨架。整合素分子的结构特点使其成为动物细胞内外信号双向转导过程中的关键分子之一，它能介导细胞膜双向信号转导，即通过调控细胞外的信号从而调控其与细胞外配体的结合活性；同时，细胞外基质与整合素的结合诱导细胞内的信号传递过程。整合素在多种生理活动中具有重要的功能，它们调节细胞的迁移、极性、生长、分化，并与基因表达的信号转导元件相互作用[1-3]。在植物中，整合素尚未被证实，有可能是因为植物已经将这些蛋白功能以不同于哺乳动物细胞的方式进行组合，以适应植物质膜的独特结构，并与细胞壁相互作用[4]。自从Schindler等首次发现与动物整合素具有相似功能的类整合素蛋白以来，在植物中已经确定了许多类整合素蛋白[5-6]。

Nagpal等在1999年报道了在拟南芥cDNA库中用抗脊椎动物整合素β1亚基胞内高度保守结构域抗体作探针分离和鉴定出1个与整合素具有部分相似序列的cDNA克隆——AT14A，这为植物类整合素的存在提供了直接证据。AT14A（At3G28300）编码基因有1个1 154 bp的开放阅读框，只存在1个外显子，由1 459个核苷酸组成，其中10至1 164位核苷酸组成编码385个氨基酸的蛋白，分子量预测为43 ku。序列分析发现，AT14A蛋白有1个小的结构域与真菌、昆虫和人类的整合素存在序列相似性，并有1个编码11个氨基酸的高度保守区，它与人类D1整合素胞内结构域同源性较高[7]。笔者前期研究表明，拟南芥AT14A蛋白功能类似于动物中的整合素，介导了悬浮细胞细胞壁-质膜-细胞骨架连续体（WMC）的连接[8]。然而，关于AT14A发挥生理功能的机制尚不清楚。

转录组学是新兴的研究细胞表型和功能的重要手段，在研究基因结构、表达和功能上开拓了新型研究方向。转录组（transcriptome）概念最先是由Velculescu等在1997年提出的，是指某一特定生物体在特定状态下所有基因转录产物的总和，主要包括mRNA、非编码RNA[9]。相对于基因组而言，转录组更具有时间性、空间性，转录组反映的是特定条件下活跃表达的基因[10]，基因芯片技术是转录组学分析的常用方法。它起源于20世纪90年代，是指高密度固定在硅片、玻片、陶瓷等固相支持介质上的生物分子微阵列，具有快速、高效、微型化、高通量、大规模、高度并行性等特点[11]。因此，本研究通过基因芯片技术分析AT14A对拟南芥基因表达的影响，从而探讨AT14A的功能，以期为类整合素的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的植物材料是拟南芥（Arabidopsis thaliana）。at14a基因位于3号染色体上，编号为AT3G28300。以野生型（Col）、纯合突变体（at14a）（SALK_101761）2种基因型拟南芥为材料。野生型拟南芥（Col）由加拿大大不列颠哥伦比亚大学陈金桂博士提供，后经笔者所在实验室自行繁种保存。at14a是AT14A的T-DNA插入功能缺失突变体。以不同组织的拟南芥为材料，提取总RNA，用于at14a基因的表达分析。以生长6周的拟南芥叶片为材料，提取总RNA，用于基因芯片分析。

1.2 试剂

总RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技（北京）有限公司]；cDNA第1链合成试剂盒（Roche）；RT-qPCR Mix（Bio-Rad）；RNA提取和反转录过程中所用EP管及枪头均为无菌级（美国Axygen公司）；荧光定量PCR试剂盒：SYBR Green Supermix（美国BIO-RAD公司）；Taq DNA 聚合酶：Thermo Scientific DreamTaq Green DNA聚合酶。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.3 荧光定量PCR方法

根据植物总RNA提取试剂盒的说明，提取拟南芥叶片总RNA，并参照反转录试剂盒的说明，以总RNA为模板，反转录为cDNA，用于at14a的表达分析。以拟南芥数据库中的at14a基因编码序列为参照，用Primer 5软件设计at14a基因定量PCR引物。以根、茎、叶、花等组织的cDNA 为模板，扩增拟南芥at14a基因，进行表达量分析。反应体系20 μL，其中上下游引物各0.5 μL，定量PCR混合液10 μL，模板cDNA 1 μL，补双蒸水至20 μL。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，导出数据使用ABI 7300自带软件进行定量分析。

1.4 基因芯片分析

1.4.1 RNA样品制备及芯片杂交 采用Trizol法提取拟南芥叶片中的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，并进一步采用RNeasy Mini Spin Column试剂盒对总RNA进行柱纯化，用分光光度计定量、甲醛变性胶电泳质检。采用RNA扩增标记方法合成带生物素标记的cRNA，将纯化后的cRNA与Agilent 公司拟南芥全基因组芯片杂交过夜，然后在芯片工作站进行芯片洗脱，采用芯片扫描仪进行扫描。这些工作均由北京博奥生物有限公司完成，每个样品重复3次。

1.4.2 芯片图像的采集与数据分析 采用Feature Extraction图像分析软件对芯片图像进行分析，将图像信号转化为数字信号。然后对信号值进行归一化处理，用SAM（Significance Analysis of Microarrays）软件进行差异基因的分析。FDR控制在5%以内，再以倍数变化大于2倍或小于50%的标准筛选差异基因。

1.5 生物信息学分析

本试验通过TAIR Gene Ontology （GO） Annotations tool （http：//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp ）和MAS（Molecular Annotation System）系统对差异基因进行分析。

1.6 统计分析

研究中每个值的表达方式为“平均值±标准误差”，不同处理之间进行了多重比较，所有数据进行了单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 at14a的组织表达特性

图1表明，在拟南芥根、茎、叶和花各组织中，at14a都有表达，尤其是叶片中的at14a基因表达量最高，根、茎中的at14a表达量最低，花中at14a表达量居于两者之间。

2.2 总RNA质检和芯片杂交质量检测

采用Trizol法提取6个拟南芥样本叶片的总RNA，纯化后，紫外分光光度计测定D230 nm、D260 nm、D280 nm，计算出各RNA样品的浓度（表1）。由图2可知，RNA样品电泳条带清晰。总体看出，RNA样品的纯度、总量及完整性符合Agilent表达谱芯片试验要求，可以继续后续芯片试验。

6个样本纯化后cRNA产物分别与芯片进行杂交和扫描，芯片杂交扫描结果显示拟南芥基因组中所有基因表达的荧光原始信号强度。由图3可知，芯片四周边界点线均匀一致，表明芯片质量可靠。信号检测报告表明：样品各项检测参数达到质控要求，杂交控制探针等阳性对照信号、看家基因信号值正常；平均背景值与噪音值较低；阳性率数值正常。这些结果说明，本组基因芯片的质量、杂交和检测体系均无问题，芯片检测结果可靠。

2.3 不同基因型拟南芥转录组分析

通过软件对野生型（col）和缺失突变体（at14a）植株叶片的差异基因进行了分析。由图4可知，野生型与缺失突变体植株的差异基因共194个，其中122个上调，72个下调。

2.3.1 不同基因型拟南芥差异基因的基因本体（Gene Ontology）分析 Gene Ontology数据库旨在建立注释基因和蛋白质知识的标准词汇体系。GO功能注释包括细胞定位（cellularcomponent）、分子功能（molecular function）、生物学过程（biological processes），3者紧密联系，共同描述基因的特征。细胞定位是指基因产物在细胞中的位置；分子功能描述基因或基因产物的分子生物学活性和功能；生物学过程通常由多种分子功能有序组成。通过Gene Ontology分析，有助于更好地了解拟南芥at14a缺失后，植株基因表达的变化规律。由图5-A可知，2个基因型植株叶片差异基因参与的生物过程多种多样，如细胞代谢、应答胁迫、运输、信号转导、转录等，应答胁迫是其中比较重要的过程。这从转录水平上说明，定位于质膜的at14a作为细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的中间分子，可能在拟南芥响应胁迫过程中起关键作用。由图5-B可知，2个基因型植株叶片差异基因主要定位于细胞核，分布比例高达20.35%，其次是细胞质、细胞内、叶绿体等部位。这为at14a定位于质膜，并参与细胞壁的组成提供了组织基础。由图5-C可知，2个基因型植株叶片差异基因主要具有绑定功能，还有转移酶活性、激酶活性、水解酶活性等功能。这表明at14a具有和其他基因相互作用的分子基础。

2.3.2 不同基因型拟南芥差异基因的Pathway分析 日本京都基因和基因组百科全书（KEGG）是生物系统学的数据库，它整合了细胞功能、生物体特性知识，描述了分子间相互作用。由图6可知，2种基因型植株叶片差异基因参与的代谢途径多种多样，如核糖体代谢、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖代谢、与细胞色素P450相关的异源性代谢、叶绿素卟啉环代谢、乙醛酸代谢、色氨酸代谢、光合代谢等。这些结果表明，at14a可能参与这些代谢途径的调控。

3 讨论与结论

叶片在植物光合作用、蒸腾作用、水和营养物质的吸收等过程中发挥重要作用，从而影响整个植物的生长和发育。因此，叶片组织的转录组学研究在植物转录组学的研究中具有举足轻重的作用。at14a在叶片中表达较高，这为它在生物进程中发挥功能提供了组织基础。

近期的研究表明，AT14A是WMC连续体中必不可少的核心分子，可以作为植物细胞壁和细胞骨架之间的连接载体，与动物整合素一样，在控制极性和形态中起重要作用。它参与了细胞质膜与细胞壁间的黏附，并参与了渗透胁迫诱导的质-壁分离过程[8]。越来越多的证据表明，在植物细胞中WMC连续体对胁迫起重要的调控作用，但是它通过膜蛋白介导的分子机制还不清楚。相关研究表明，植物类整合素参与了霉菌毒素的渗透作用、机械刺激应答、细胞壁黏附等[12]。笔者的研究也发现，2个基因型植株差异基因主要参与了应答胁迫过程。

AT5G39610（ATNAC2）是编码NAC结构域的转录因子。

在盐胁迫下，野生型、NTHK1转基因株系中该基因表达上调；此外，它还参与氧化胁迫[13]。AT4G32770（VTE1）编码生育酚环化酶，与生育酚（维生素E）的合成有关，它参与应答高光、氧化、低温等逆境胁迫过程[14]。AT1G53240（MMDH1）编码线粒体苹果酸脱氢酶，它参与冷胁迫和盐胁迫应答过程，并参与细菌防御反应；它还参与苹果酸、三羧酸循环等碳水化合物的代谢过程[15]。AT1G02920（GST11）编码谷胱甘肽转移酶，具有和钴离子、铜离子、谷胱甘肽结合的功能，它定位于细胞质、细胞核和液泡等部位，参与应答盐胁迫、细菌和真菌防御，还参与谷胱甘肽代谢和毒素分解代谢等途径[16]。AT1G10760（SEX1）编码淀粉降解所需的α-葡聚糖水合二激酶，它具有α-葡聚糖水合二激酶活性，能与ATP、金属离子结合，它定位于叶绿体、线粒体等部位，参与了应答冷胁迫过程，与淀粉分解途径有关[17]。AT14A可能通过调控这些逆境相关胁迫基因的表达，从而参与了拟南芥响应逆境胁迫过程。

本试验通过转录组学和生物信息学的方法初步分析了拟南芥缺失突变体at14a的基因表达变化及其参与的生物学过程和代谢途径等，分析结果较直观，为进一步研究at14a作用的分子机制奠定了基础。

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