猪源乳酸菌的分离及其生物学性能研究

李琳琳，王雅婷，杨　欣，周罗雄，王利红，杜恩岐

(西北农林科技大学 a 动物医学院，b 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)



猪源乳酸菌的分离及其生物学性能研究

李琳琳a，王雅婷a，杨欣b，周罗雄b，王利红b，杜恩岐a

(西北农林科技大学 a 动物医学院，b 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

[摘要]【目的】 从猪新鲜粪便和肠道黏膜中筛选乳酸菌，为猪益生剂饲料添加剂提供理论依据和可靠菌种。【方法】 采集陕西八眉猪的粪便和肠道组织，分离纯化乳酸菌，通过体外耐酸、耐胆汁试验以及抑菌试验和黏附试验，筛选特性优良的益生菌，用16S rRNA基因序列系统发育树确定其分类地位。采用小鼠安全性检验试验，检测筛选菌株的安全性。【结果】 筛选出一株耐受性和抑菌性良好，生长曲线稳定且黏附性较好的乳酸菌，命名为FB027；另一株抑菌性和黏附性良好，生长曲线稳定且耐酸、耐胆盐较好的乳酸菌，命名为SE013。16S rRNA基因序列系统发育树分析发现，FB027为非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)，进化与同属的血红链球菌Streptococcus sanguinis (GenBank登录号CP000387.1)同源性最高，SE013为肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，进化与同属的伪明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides (GenBank登录号AB572039.1)同源性最高。小鼠安全性检验试验发现，连续2周口服乳酸菌FB027和SE013，小鼠健康状况良好，行为、生长、采食量和病理组织剖检均无明显异常。【结论】 分离获得了性能优良的2株乳酸菌，其在猪饲料添加剂方面有潜在的应用前景。

[关键词]猪；乳酸菌；分离鉴定；生物学特性

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是指一类可发酵碳水化合物，产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称，包括乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等。乳酸菌是国际公认的食品级安全微生物(GRAS)，对人类、动物和植物的健康都有益[1]。作为重要的工业微生物，乳酸菌及其代谢产物被广泛应用于食品、医药、饲料、精细化学品等工业领域中，应用较广泛的有乳酸杆菌、乳酸链球菌、明串珠菌和嗜热链球菌[2-3]。乳酸菌可发酵产生有机酸(乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等)和抗菌肽等生物活性分子，这些代谢产物不仅可以抑制食物中有毒细菌和腐败细菌的生长，防止食物腐败变质，还能起到解毒作用，分解食物中的毒素分子[4-5]。众所周知，临床应用抗生素取得了很好的预防和治疗效果，但长期使用也产生诸多副作用，一方面使耐药菌株增加，耐药因子迅速扩散；另一方面引起肠道菌群紊乱，造成肠道功能失调。而乳酸菌作为微生态制剂的菌种之一，由其所生产的微生态制剂可直接饲喂动物，它以活菌形式在动物消化道中与病原菌通过竞争性抑制作用增强动物免疫力，并直接参与胃肠道微生态的平衡，调节胃肠道功能。因此，乳酸菌的应用越来越被重视。

八眉猪主要分布于陕西泾河流域、甘肃陇东和宁夏的固原等西北地区。该品种猪具有适应性强、抗逆性好、产仔多、保育性好、肉质好、肉味香、易于饲养管理、性状遗传稳定、与国内外良种猪杂交杂种优势明显等特性，是我国西北地区优良的地方品种，具有很高的保护和利用的价值[6-7]。本研究以陕西八眉猪为试验对象，从其粪便和肠道内分离乳酸菌，并对乳酸菌耐受性、黏附特性、抑菌性、安全性等进行检测，以期为进一步研制猪用微生态制剂奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂主要培养基有MRS培养基、含5 g/L碳酸钙的MRS培养基(以下简称CaCO3-MRS)、LB培养基。胆汁，Sigma；异硫氰酸荧光素(FITC)，北京全式金生物技术有限公司；鼠伤寒沙门氏菌、Caco-2细胞和胎牛血清，均由西北农林科技大学动物科学院赵辛老师实验室提供。

1.1.2试验动物BALB/c 小鼠，购于西安交通大学；陕西八眉猪，由西北农林科技大学动物医学院干细胞研究中心提供。

1.2方法

1.2.1样品采集用酒精棉消毒不锈钢药勺，用其取新鲜的陕西八眉猪粪便样品2份装入样品袋，编号，低温保存。截取宰后健康陕西八眉猪的十二指肠、空肠、回肠，剖开肠道并用无菌生理盐水冲洗干净，刮取肠壁内表面黏膜样品5份，收集到无菌管中，编号，低温保存。

1.2.2乳酸菌的分离与纯化称取10 g样品于90 mL无菌生理盐水(含5 mm玻璃珠)中，37 ℃、180 r/min振荡30～60 min，使样品充分打散混匀。取1 mL悬浮液用生理盐水进行10倍梯度稀释。每个梯度取1 mL稀释液，加入25 mL未凝固的CaCO3-MRS固体培养基中，混匀倒平板，37 ℃倒置培养24 h。挑取有透明融钙圈且形态、大小、颜色、光泽、边缘、表面隆起度、透明度等各异的菌落，多次接种纯化，至形成单一菌落，4 ℃保存备用。

1.2.3乳酸菌的耐酸性检测将活化好的菌株，按体积分数5%接种量接入pH 3.0的MRS液体培养基中，以等量接入pH 6.2的MRS液体培养基为对照，37 ℃培养2 h。处理组和对照组各取200 μL混合培养液涂板，用平板计数法检测活菌数量，计算酸处理存活率。计算公式如下：

酸处理存活率=处理组活菌数/对照组活菌数×100%。

1.2.4乳酸菌耐胆汁性试验将活化好的菌株，按体积分数5%接种量接入含0.2%牛胆汁的MRS液体培养基中，以等量接入不加胆汁的MRS液体培养基为对照，37 ℃培养2 h。处理组和对照组各取200 μL混合培养液涂板，用平板计数法检测活菌数量，计算胆汁处理存活率。计算公式如下：

胆汁处理存活率=处理组活菌数/对照组活菌数×100%。

1.2.5乳酸菌的抑菌性试验用牛津杯法检测。以鼠伤寒沙门氏菌为指示菌，测定分离菌株的抑菌活性。将活化培养的指示菌按体积分数1%接种量接入100 mL LB固体培养基中，混匀，缓缓倒入均匀放置了3个无菌牛津杯的平板中，待培养基凝固后，用镊子拔出牛津杯，一个牛津杯孔加入200 μL MRS液体培养基为对照，另2个孔加入200 μL分离菌株培养液，待孔内液体完全扩散后，37 ℃倒置培养24 h。用游标卡尺测量各孔抑菌圈直径，用抑菌圈直径大小表示菌株的抑菌性强弱。

1.2.6乳酸菌的细胞黏附试验Caco-2细胞培养：Caco-2细胞培养于含体积分数10%热灭活胎牛血清的DMEM细胞培养液中，调整细胞数量为2×105mL-1，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中，隔天换1次培养液，至细胞贴壁生长为单层细胞(需5～7 d)[8]。

细菌标记：培养细菌至对数生长期，收集菌体，用无菌PBS (pH 7.4)洗涤并调整菌液中细菌含量为1×108CFU/mL，将悬浮液与100 μg/mL FITC在37 ℃避光共孵育2 h。用PBS (pH 7.4)洗涤2次，以除去未结合的FITC，将标记菌悬浮于5 mL PBS (pH 7.4)中[9-10]。

黏附试验：将培养好的单层Caco-2细胞用无菌生理盐水冲洗2次，并用1 mL DMEM悬浮，加入1 mL荧光标记的乳酸菌，以加入等量无菌PBS (pH 7.4)的细胞为空白对照组，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中共孵育1 h。孵育结束后，用无菌PBS (pH 7.4)温和洗涤2次，洗脱未黏附的细菌，收集细胞培养液，用酶标仪测定其荧光强度，吸收光波长为485 nm，发射光波长为530 nm，测定相对荧光强度，计算黏附率[8-10]。每组设6个重复，每个培养孔为1个重复。黏附率计算公式如下：

细菌的黏附率=细菌黏附Caco-2细胞并洗脱后细胞悬液的相对荧光强度/细菌黏附Caco-2细胞前细胞悬液的相对荧光强度×100%。

1.2.7乳酸菌菌株鉴定及系统发育树分析根据细菌类16S rRNA保守序列，利用Primer 5.0软件设计引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，引物由北京全式金生物技术有限公司合成。以分离菌株的DNA为模板，双蒸水为阴性对照，利用上述引物进行PCR扩增并测序，在GenBank中进行BLAST序列分析，并用贝叶斯法(Bayesian inference，BI)构建系统发育树。

PCR扩增体系(50 μL)：2×MixTaq酶25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1.25 μL，双蒸水补足50 μL。PCR反应程序：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环，再72 ℃延伸10 min。

1.2.8乳酸菌生长曲线测定将活化后的菌株，按体积分数1%接种量接入新鲜MRS液体培养基中，37 ℃静置培养。以MRS空白液为对照，每隔2 h取细菌培养液于600 nm测定吸光度(OD600)，并取1 mL菌液进行梯度稀释，进行平板计数，持续检测24 h。

1.2.9小鼠安全性检验试验取6～8周龄的BALB/c 雄性小鼠，体质量(20±2) g/只，随机分成2个试验组和1个对照组，共计3组，每组15只，整个试验过程自由采食和饮水。将2株待测乳酸菌(FB027和SE013)培养到对数生长期，用无菌PBS (pH 7.4)洗涤并调整其含量为1×109CFU/mL。2个试验组小鼠每天分别口服1次200 μL的待测乳酸菌液，对照组小鼠每天口服1次200 μL的PBS (pH 7.4)，连续14 d，观察小鼠生长情况。试验结束后，取各组小鼠十二指肠、回肠和结肠黏膜进行乳酸菌计数。

2结果与分析

2.1猪源乳酸菌的分离纯化

7份样品(2份猪粪便、5份猪肠道黏膜刮取物)经分离纯化共获得56株不同形态的乳酸菌，菌落形态为圆形或椭圆形、乳白色或半透明、边缘整齐、表面光滑、中间隆起；有融钙圈，接触酶反应均为阴性，革兰氏染色均为阳性，菌体形态为杆状或链球状，无芽孢，单个、2个或多个一线排列。平板计数发现，粪便中乳酸菌数量高达108CFU/g，有21种不同的形态类型；肠道(十二指肠、空肠、回肠)黏膜内乳酸菌数量为104CFU/g，有35种不同的形态类型。

2.2猪源乳酸菌的耐酸性试验

正常情况下，猪胃的pH约为 3.0, 流体食物在胃内停留时间为1～2 h[11]，小肠pH在4.0～5.5，大肠pH大于5.0[12]，耐酸性是保障益生乳酸菌通过胃后能存活的先决条件。分离纯化的56株菌，经过pH 3.0的MRS液体培养基处理后，有27株菌存活率达到90%以上，其余菌株对酸较敏感，表明有27株菌对酸性环境的适应性较好。

2.3猪源乳酸菌的耐胆汁试验

乳酸菌随着食物进入口腔，最终到达小肠末端，猪小肠中胆盐含量在0.03%～0.3%内波动[12]，因此乳酸菌要到达并定殖于肠壁，必须对胆盐有一定的耐受力，而胆汁是胆盐的主要成分。从试验结果可知，酸耐受性较好的27株菌经含体积分数0.2%牛胆汁的MRS液体培养基处理后，有8株菌的耐受性较好，其余菌株对胆汁较敏感，其中SE013的耐胆汁性存活率最高达到54.20%(表1)。

表 1　分离乳酸菌的生物学性能

2.4猪源乳酸菌的抑菌试验

以上述耐酸性和耐胆汁性较好的8株菌作为试验菌株，以鼠伤寒沙门氏菌为指示菌，进行抑菌性的分析，抑菌圈直径的大小反映了待测菌株对致病菌体外抑制能力的强弱。试验结果(表1)显示，KC015、SE013、SE007这3株菌的抑菌圈直径均较大，说明其对鼠伤寒沙门氏菌有较强的抑制作用。

2.5猪源乳酸菌的细胞黏附试验

乳酸菌要在肠壁上定殖并大量繁殖，必须对宿主细胞有较强的黏附性。由表1中不同乳酸菌对Caco-2细胞的黏附率可知，FB027的黏附能力最强(黏附率为9.713%)， FB048、SE013次之，说明这3株菌可以很好的在肠壁定殖。

2.6猪源乳酸菌的鉴定

通过上述生物学性能分析，对筛选的8株菌进行16S rRNA序列分析，均扩增出1.5 kb左右的片段(图1)，测序结果经过GenBank比对分析， 3株菌(FB027、FB034、FB048)为非解乳糖链球菌；肠道来源的5株菌中，4株菌(KC004、KC015、SE001、SE007)为魏斯氏菌，1株菌(SE013)为肠系膜明串珠菌(表1)。

图 1　猪源乳酸菌16S rRNA基因片段的PCR扩增结果

2.7猪源乳酸菌的系统发育树分析

细菌16S rRNA具有功能和进化上的同源性，在整体结构上极端保守，携带的生物信息可用来进行可靠的系统进化分析，以准确定位细菌菌株的分离地位[13]。本研究选择猪源乳酸菌FB027和SE013为代表菌株，进行系统发育树分析。

从GenBank中提取链球菌属代表菌株的16S rRNA序列，包括停乳链球菌Streptococcusdysgalactiae(GenBank登录号：AP011114.1，下同)、化脓性链球菌Streptococcuspyogenes(CP003116.1)、唾液链球菌Streptococcussalivarius(AB608747.1)、猪链球菌Streptococcussuis(AF009507.1)、乳房链球菌Streptococcusuberis(AM946015.1)、血红链球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)、巴黎链球菌Streptococcuslutetiensis(JN713319.1)、无乳链球菌Streptococcusagalactiae(NC_004116.1)，以乳杆菌Lactobacillussunkii(AB366385.1)为外群，用ClustaⅨ进行多序列比对，贝叶斯法(Bayesian inference，BI)进行进化分析，用Tree View程序构建FB027与以上菌株系统发育树，结果见图2。由图2可知，FB027(Streptococcusalactolyticus)与血红链球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)系统发育关系最近。

图 2　基于部分16S rRNA基因序列的猪源乳酸菌FB027的系统发育树

从GenBank中提取明串珠菌属代表菌株的16S rRNA序列，包括冷明串珠菌Leuconostocgelidum(AB022921.1)、肉色明串珠菌Leuconostoccarnosum(AB022925.1)、柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum(AB022923.1)、伪明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1)、棕榈明串珠菌Leuconostocpalmae(AM940225.1)、乳酸明串珠菌Leuconostoclactis(NR_040823.1)、inhae明串珠菌Leuconostocinhae(AY117686.1)、阿根廷明串珠菌Leuconostocargentinum(AF175403.1)，以saguini明串珠菌Bifidobacteriumsaguini(AB559504.2)为外群，用ClustaⅨ进行多序列比对，用Tree View程序构建SE013与以上菌株系统发育树，结果见图3。由图3可知，SE013(Leuconostocmesenteroides)与伪明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1) 系统发育关系最近。

图 3　基于部分16S rRNA基因序列的猪源乳酸菌SE013的系统发育树

2.8猪源乳酸菌的生长曲线测定结果

选择猪源乳酸菌FB027和SE013为试验菌株，进行生长曲线测定。由图4可以看出，FB027、SE013这2菌株的生长趋势较一致， 2～10 h为对数生长期，12 h左右进入稳定生长期。平板计数法检测结果显示，在10 h时2株菌的活菌数均达到109CFU/mL以上，具有很强的增殖能力。

2.9猪源乳酸菌的安全性检验

选择猪源乳酸菌FB027和SE013为试验菌株，进行动物安全性试验检测。试验期间，试验组和对照组小鼠的生长情况均正常，行为活动和采食量没有明显变化，也无相关疾病或死亡发生。解剖观察发现，试验组与对照组小鼠内脏器官没有明显差异，均无肝脏或脾脏肿大现象。取各组小鼠的十二指肠(SE)、回肠(HC)和结肠(JC)黏膜进行乳酸菌计数，结果(图5)发现，试验组(口服FB027和SE013)小鼠肠道中乳酸菌数量均明显高于对照组(口服PBS)，说明这2株乳酸菌均可改善小鼠肠道内菌群结构，更利于乳酸菌的生长。

图 4　猪源乳酸菌FB027和SE013的生长曲线

3讨论

近年来，乳酸菌类益生菌被广泛应用于养猪业，使用的乳酸菌类型也是多种多样。有学者认为，肠道菌与寄主之间存在特殊的相互关系，所以理想的益生菌菌种应该来自同源动物，这样才能增强益生菌的特异性功效[14]。因此，本研究以健康猪的粪便和肠道黏膜为样本，筛选特性优良的乳酸菌，为选择更合适的猪用微生态饲料添加剂提供理论依据及可靠菌种。

本试验从陕西八眉猪的7份样品中最终分离得到3株非解乳糖链球菌(Streptococcusalactolyticus)、4株融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)和1株肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。通过酸和胆汁耐受试验及细胞黏附试验，筛选出了1株黏附能力较强的菌株FB027(非解乳糖链球菌)和1株酸和胆汁耐受性较强的菌株SE013(肠系膜明串珠菌)，小鼠口服试验结果也证实了以上2株菌的安全性，因此推测FB027、SE013这2株菌具有作为猪饲料添加剂的潜力。

非解乳糖链球菌最早由Farrow等[15]从猪肠道和鸡粪便中分离并报道，后来Rinkinen等[16]从狗的空肠和粪便中也发现非解乳糖链球菌是主要菌群。Czerwiński等[17]报道鸡盲肠的主要定殖微生物是非解乳糖链球菌。在本试验中，3株非解乳糖链球菌均分离自猪粪便，其中FB027对Caco-2细胞有较高的黏附性，且经系统发育树分析，与血红链球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)亲缘关系最近。明串珠菌在植物产品发酵中的应用已经较为广泛，但是将其作为益生菌，应用于动物生产的报道很少。Kekkonen等[18]经过临床试验证实，应用明串珠菌作为益生菌诱导细胞因子的功效明显优于乳酸杆菌。Allameh等[19]首次尝试了将分离自墨鱼肠道的肠系膜明串珠菌作为益生菌添加剂，在水产养殖中提高了鱼产量。本试验所分离的肠系膜明串珠菌SE013对酸和胆汁具有较高的耐受性，且经系统发育树分析，SE013与伪明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1)亲缘关系最近。

根据Rammelsberg等[20]抑菌性分析的标准，抑菌圈直径< 11 cm为弱抑菌，抑菌圈直径11～16 cm为中抑菌, 抑菌圈直径>17 cm为强抑菌。本试验中，FB027、SE013抑菌圈直径分别为14.0和 15.5 cm，抑菌能力相近且均达到中等标准。由 Caco-2 细胞黏附试验结果可知，FB027黏附率最高(9.713%)，具有很高的黏附特性，而SE013黏附率为1.518%，基本可以附着在肠壁细胞。

根据FAO/WHO (2006)标准，益生菌筛选须满足以下3个基本特点：(1)耐受胃肠黏膜的选择性环境；(2)黏附宿主的肠壁细胞；(3)分泌物或者分解产物为抗菌物质[21-22]。而且不同性能的菌株混合使用时，有互补作用，效果更佳[23]。本试验所分离的2株菌(FB027、SE013)生物学性能各有优势，而且分离自健康猪粪便或肠道，采用从猪体内分离的乳酸菌作为猪饲料活性菌添加剂，来提高猪产量和质量，具有更好的潜在应用价值。后续研究中应进一步通过扩大采样数量和采样范围，有望筛选到同时具备以上3个基本特性,且更具应用潜力、高效安全的乳酸菌。

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Isolation and characterization of lactic acid bacteria from swine

LI Lin-lina,WANG Ya-tinga,YANG Xinb,ZHOU Luo-xiongb,WANG Li-hongb,DU En-qia

(aCollegeofVeterinaryMedicine,bCollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study isolated lactic acid bacteria from feces and intestinal mucosa of Bamei swine to provide theoretical support and reliable strains for swine probiotic feed additive.【Method】 Feces and intestinal tissue of Shaanxi Bamei swain were collected and lactic acid bacteria were purified.Then,excellent lactic acid bacteria strains were selected by acid and bile resistance,cell adherence and antimicrobial activity experiments,and their taxonomic status was identified by the phylogenetic tree of 16S rRNA.At last,oral administration experiment of mice was conducted to confirm the safety of selected strains. 【Result】 Two excellent lactic acid bacteria strains were selected.The one named FB027 had good tolerance and antibacterial ability,stable growth curve,and better cell adherence activity.The other one named SE013 had good antibacterial and cell adherence activity,stable growth curve,and good acid and bile resistance.According to the phylogenetic tree of 16S rRNA,FB027 was identified as Streptococcus alactolyticus and was highly similar to Streptococcus sanguinis (GenBank No CP000387.1) while SE013 was identified as leuconostoc mesenteroides and was highly similar to Leuconostoc pseudomesenteroides (GenBank No AB572039.1).Furthermore,the two-week continuous oral administration of FB027 and SE013 to mice confirmed that the two strains were healthy without obviously abnormal behaviors,growth,declining food intake and typical anatomy pathological changes.【Conclusion】 The two strains had the potential to be used as feed additives for swine in the future.

Key words:swine;lactic acid bacteria;isolation;biological characterization

DOI：网络出版时间:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.001

[收稿日期]2014-05-04

[基金项目]国家自然科学基金项目(31201939)

[作者简介]李琳琳(1989-)，女，山东济宁人，在读硕士，主要从事预防兽医学研究。E-mail:lill.sky@163.com[通信作者]杜恩岐(1977-)，男，陕西西安人，副教授，博士，主要从事新型动物疫苗及纳米抗体的研究。

[中图分类号]S852.6

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)02-0001-07

E-mail:duenqi227@126.com