夏枯草水提物对肝损伤小鼠的保护作用

陈　彤，苏月华，黄余琳，邱龙新

(1 龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364000；2 福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，福建 龙岩 364000)



夏枯草水提物对肝损伤小鼠的保护作用

陈彤1,2，苏月华1，黄余琳1，邱龙新1,2

(1 龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364000；2 福建省预防兽医学与兽医生物技术重点实验室，福建 龙岩 364000)

[摘要]【目的】 研究夏枯草水提物对CCl4所致慢性肝损伤小鼠的保护作用。【方法】 制备1 g/mL(以生药计)的夏枯草水提物，用不同剂量的夏枯草水提物(0.5，1，2 g/kg)每日灌胃小鼠，共5周，设立空白组和模型组，每日灌胃相同体积的生理盐水。除空白组注射植物油外，其余4组小鼠按5 mL/kg剂量腹腔注射体积分数1% CCl4植物油溶液，每周2次共3周，建立慢性肝损伤模型。于末次灌胃16 h后采血，测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和丙二醛(MDA)浓度，并取肝脏样品制备肝组织匀浆，测定其中乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)，同时制备肝脏病理切片，观察肝组织病理组织学变化。【结果】 与模型组相比，夏枯草水提物可明显降低血清ALT和AST活性、MDA浓度，提高肝组织匀浆中CAT、SOD活性以及T-AOC，降低LDH活性。显微观察结果显示，模型组小鼠肝小叶结构严重破坏，未见肝索和肝窦，肝细胞普遍变性；而夏枯草水提物各剂量组小鼠肝组织病灶逐渐缩小，病灶区部分肝细胞变性现象逐渐好转，肝索、肝窦结构逐渐出现。【结论】 夏枯草水提物对CCl4所致慢性肝损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与抗氧化作用有关。

[关键词]夏枯草水提物；CCl4；慢性肝损伤；小鼠

肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病，嗜酒、环境中的化学毒物及某些药物都可引起肝损伤，引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变性、肝硬化和肝癌。目前，虽然已有一些治疗肝损伤的药物，但治疗效果不是很理想，且有一些不良反应，寻找有效且副作用较小的保肝药品，进行保肝治疗仍是非常重要的手段。

夏枯草属于双子叶植物唇形科(Labiatae)、夏枯草属(Prunella)，夏枯草种(P.vulgaris)[1]，其因“夏至后即枯”而得名，是一种传统的中草药，含有多种活性化学成分，具有抗菌消炎[2]、抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、免疫抑制活性[5]、抗氧化[6]、降血压[7]、降血糖等功效[8]，目前国内外有关夏枯草水提物对肝损伤保护作用的报道还较少。鉴于夏枯草有清肝、抗氧化的作用，且夏枯草资源丰富，本研究采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立小鼠慢性肝损伤模型，观察夏枯草水提物对肝损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物清洁级昆明雄性小白鼠60只，体质量(20±2) g/只，上海斯莱克实验动物有限公司提供。

1.1.2主要试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、考马斯亮兰试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，均购自南京建成生物工程有限公司；四氯化碳(CCl4)，购自福州开发区成海化工有限公司；夏枯草花穗，购自龙岩市紫金健康医药商场。

1.2方法

1.2.1夏枯草水提物的制备取夏枯草花穗100 g加入800 mL蒸馏水，浸泡30 min，蒸馏回流45 min，过滤，残渣再加入600 mL蒸馏水，蒸馏回流45 min，再次过滤，合并2次滤液。滤液经旋转蒸发仪浓缩到100 mL后，加入300 mL无水乙醇，在4 ℃冰箱中过夜沉淀。次日，取出滤液抽滤浓缩，定容至100 mL，得质量浓度1 g/mL(以生药计)夏枯草水提物，灭菌后冷藏备用。

1.2.2小鼠分组及给药处理将60只小鼠随机分为5组，即空白组、模型组及夏枯草低、中、高剂量组，每组各12只。适应性喂养5 d后开始试验，夏枯草低、中、高剂量组小鼠每日分别灌胃0.5,1.0,2.0 mg/kg夏枯草水提物，而空白组和模型组每日灌胃相同体积的生理盐水，共灌胃5周。同时除空白组注射植物油外，其余4组从试验第1天开始腹腔注射体积分数1%的CCl4植物油溶液5 mL/kg，每周2次，共注射3周6次，诱导建立化学性肝损伤模型。在末次灌胃后禁食不禁水16 h，称体质量，摘眼球取血，3 500 r/min离心10 min，分离血清，检测血清ALT、AST活性及MDA浓度。同时用断颈法处死小鼠，取肝脏，用冷生理盐水制备质量分数10%的肝组织匀浆，按试剂盒说明测定SOD、CAT、LDH活性和T-AOC。

1.2.3肝组织病理切片制作取肝左叶同一部位组织块，用生理盐水漂洗，拭干，浸入体积分数10%的中性福尔马林溶液中固定24 h后，用体积分数75%，85%，95%，95%，100%，100%，100%酒精梯度脱水各1 h，二甲苯透明，石蜡包埋，切片脱蜡至无水，常规HE染色，经脱水、透明后封片。光学显微镜下观察肝组织切片的病理学变化。

1.3数据处理与分析

运用SPSS 16.0 统计软件进行数据分析，数据用“平均值±标准偏差”表示，组间采用单因素方差分析，P<0.05 表示差异显著。

2结果与分析

2.1夏枯草水提物对小鼠血清ALT、AST、MDA的影响

由表1可知，空白组ALT和AST活性均显著低于模型组(P<0.05)，MDA浓度极显著高于空白组，表明肝损伤模型建模成功，肝细胞已受到严重破坏，胞质内酶大量流入血液，血液中MDA浓度、ALT和AST活性增加。夏枯草高剂量组和中剂量组的ALT、AST活性及MDA浓度均显著低于模型组(P<0.05)；夏枯草低剂量组的ALT、AST活性及MDA浓度也低于模型组，但差异不显著(P>0.05)。

注：与空白组相比， 标#者表示差异显著(P<0.05)，标##者表示差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，标*者表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note:# indicatesP<0.05，## indicatesP<0.01 compared to normal group;* indicatesP<0.05 compared to model group.The same below.

2.2夏枯草水提物对小鼠肝组织匀浆LDH、CAT、T-AOC、SOD的影响

由表2可知，与模型组比较，空白组LDH活性显著降低(P<0.05)，T-AOC、SOD活性显著升高(P<0.05)，CAT活性极显著升高(P<0.001)；与模型组相比，夏枯草各剂量组LDH活性降低，其中夏枯草高剂量组与模型组差异达显著水平；T-AOC、SOD活性明显升高，CAT活性显著或极显著升高，且呈明显的剂量关系。

表 2　夏枯草水提物对肝损伤小鼠肝组织匀浆LDH、CAT、T-AOC、SOD的影响

注：与空白组相比，标###者表示差异极显著(P<0.001)；与模型组相比，标**和***者表示差异极显著(P<0.01，P<0.001)。

Note:### indicatesP<0.001 compared to normal group;** and *** indicateP<0.01 andP<0.001 compared to model group.

2.3夏枯草水提物对小鼠肝组织病理学的影响

由图1可见，空白组肝组织结构正常，肝索结构清晰可辨，肝窦未见异常，肝细胞结构及形态正常，胞质丰富，细胞核大而圆(图1-a，A)；模型组小鼠肝小叶结构严重破坏，未见肝索及肝窦，肝细胞普遍变性，细胞浑浊肿胀，胞浆疏松，呈气球样变，细胞核固缩(图1-b，B)；夏枯草低剂量组小鼠肝组织病灶有所缩小，病灶区胞浆的疏松程度及细胞核固缩程度也有所减轻(图1-c，C)；夏枯草中剂量组病灶面积进一步缩小，病灶区部分肝细胞结构正常，可见肝索，但肝窦充血扩张较明显(图1-d，D)；夏枯草高剂量组的病灶面积小，肝索结构基本清晰，肝细胞排列比较整齐，细胞核形态较正常，肝组织结构趋于正常，肝窦轻度充血扩张(图1-e，E)。以上结果说明，夏枯草水提物对慢性肝损伤有一定程度的保护作用。

3讨论

CCl4致肝损伤动物模型是用来评价改善肝细胞损伤药物的经典实验性模型，其公认的肝损伤机制是脂质过氧化。CCl4进入机体后由肝微粒体中细胞色素P450代谢生成三氯甲基等自由基，攻击肝细胞膜或激活膜上的磷酸化酶，引起生物脂质过氧化，破坏生物膜的结构和功能完整性，使其通透性增高，最终导致细胞坏死[9-10]。ALT主要存在于肝细胞的胞浆中，AST存在于线粒体中，当CCl4造成生物膜损伤时，肝细胞中ALT、AST大量释放进入血液，导致血液中ALT、AST活性升高，故检测血清中的ALT、AST活性可反映肝细胞的损伤程度[11]。 在本试验中，注射CCl4后，ALT、AST活性均升高，但夏枯草各剂量组的ALT、AST活性较模型组降低，其中夏枯草中、高剂量组与模型组差异显著(P<0.05)，呈明显的剂量关系。CCl4引发肝细胞膜发生脂质过氧化时的终产物是MDA，其可严重破坏细胞膜的结构，导致细胞肿胀、坏死，其浓度反映了细胞膜脂质过氧化的损伤程度[12]。本试验结果显示，模型组血清MDA浓度极显著高于空白组(P<0.01)，夏枯草各剂量组MDA浓度较模型组降低，夏枯草中、高剂量组与模型组差异显著(P<0.05)，呈明显的剂量关系。夏枯草水提物各剂量组能明显降低ALT、AST活性和MDA浓度，说明夏枯草水提物进入机体内后，通过一系列的酶促反应，可抵抗CCl4进入机体代谢产生的自由基对肝细胞膜的脂质过氧化作用，缓解CCl4对生物膜的损害。

图 1夏枯草水提物对慢性肝损伤小鼠肝组织结构的影响(HE染色)

a、A.空白组；b、B.模型组；c、C.低剂量组；d、D.中剂量组；e、E.高剂量组；标小写字母图片的放大倍数为100，标大写字母图片的放大倍数为400

Fig.1Effect of aqueous extract ofPrunellavulgarisL.on liver tissue structure of chronic liver injury mice(H&E) a，A.Normal group;b，B.Model group;c,C.Low dose group; d,D.Middle dose group;e,E.High dose group;Lowercase letters indicate the images were magnified by 100 times while uppercase letters indicate the images were magnified by 400 times

SOD是组织细胞内主要的抗氧化酶，其活性的高低反映了组织细胞清除超氧阴离子的能力，其能催化2个超氧阴离子的歧化反应，生成过氧化氢和分子氧。CAT在清除体内的超氧自由基和过氧化氢及阻止或减少羟基自由基等方面具有重要作用[13]，其可以和过氧化氢反应生成水和分子氧，其活性高低可作为衡量细胞抗氧化水平的一项生化指标。SOD、CAT活性降低会导致体内氧自由基的积累，引起生物膜的过氧化反应，从而破坏生物膜的结构和功能，导致细胞坏死。本研究结果显示，夏枯草水提物各剂量组能提高肝损伤小鼠SOD和CAT活性，说明夏枯草水提物可通过提高体内SOD和CAT活性，增强肝组织清除超氧阴离子自由基的抗氧能力，以保护生物膜的结构和功能完整性。

T-AOC由酶促和非酶促抗氧化防御体系组成，可反映机体防御体系抗氧化能力的强弱，这个体系的防御氧化作用是通过3条途径实现的：①消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；②分解过氧化物，阻断过氧化链；③除去起催化作用的金属离子。防御体系各个成分之间相互起到了协调作用、代偿作用和依赖作用[14]。本研究结果显示，与模型组相比，夏枯草水提物各剂量组的T-AOC显著升高(P<0.05)，说明夏枯草水提物可提高肝组织的总抗氧化能力，其途径可能与清除自由基能力的提高有关。

LDH 是糖酵解酶，在肝脏、心脏等组织细胞的胞浆中含量最多，当细胞受损时，LDH外漏，使细胞间液及血清中LDH活性升高，因此LDH活性是反映肝脏损伤的指标[15]。本研究结果表明，与模型组相比，夏枯草水提物各剂量组的LDH活性呈降低趋势，其中高剂量组与模型组差异显著(P<0.05)。由此说明夏枯草水提物进入机体后通过一定的变化，能有效减轻肝细胞炎症或坏死的发生，从而对肝细胞起保护作用。

Ha等[16]报道，CCl4引起肝损伤时，在肝组织病理学切片中可观察到肝细胞的脂肪变性。本研究中，模型组小鼠肝细胞有大面积的脂肪变性，呈弥散性变性、坏死，小叶内以中央静脉为中心出现大量坏死灶，细胞核固缩、消失，炎性细胞浸润明显，不见肝索和肝窦。夏枯草水提物各剂量组小鼠肝组织病灶逐渐缩小，病灶区部分肝细胞变性现象逐渐好转，肝索、肝窦结构逐渐出现至清晰，进一步证明夏枯草水提物对CCl4所致的慢性肝损伤具有一定的保护作用。

综上分析，肝组织、血清的生化指标及肝组织病理学观察结果都显示，夏枯草水提物对CCl4所致的慢性肝损伤具有保护作用。陈彤等[17]报道，夏枯草水提物对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠也具有保护作用。因此，夏枯草是天然抗氧化、抗衰老的良好中草药，为夏枯草保肝治疗临床推广应用提供了一定的参考价值。

[参考文献]

[1]Tsimogiannis D I，Oreopoulou V．The contribution of flavonoid C-ring on the DPPH free radical scavenging efficiency：A kinetic approach for the 3′，4′-hydroxy substituted members [J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2006，7：140-146.

[2]盛丽，高农，张晓非.19味中药对琳球茵流行株的敏感性研究 [J].中国中医药信息杂志,2003，10(4):48.

Sheng L,Gao N,Zhang X F.Study on sensitivity of 19 Chinese herbal medicines onLinaureusisolates [J].Chinese Journal of Medicine，2003，10(4):48.(in Chinese)

[3]Xu H X，Lee S H S,Lee S F,et al.Isolation and characterization of an anti-HSV polysaccharide fromPrunellavulgaris[J].Antiviral Research,1999,(44):43-54.

[4]Lee H,Lin J Y.Antimutagenic activity of extracts from anticancer drugs in Chinese medicine [J].Mutagenic Research,1988,204(2):229-234.

[5]Sun H X,Qin F,Pan Y J.Invitroandinvivoimmunosuppressive activity ofSpicaprunellaethanol extract on the immune responses inmice [J].Journalof Ethnopharmacology,2005(101):31-36.

[6]F Liu,T.B.Ng.Antioxidative and free radical scanenging activtties of selected medical herbs [J].Antioxidant Activity in Medicinal Herbs，2000,66(8):725-735.

[7]何晓燕，赵淑梅，宫汝淳.夏枯草对家兔降压作用机理的研究 [J].通化师范学院学报，2002，23(5):100.

He X Y,Zhao S M,Gong R C.Study on the hypotensive action of rabbit mechanism ofPrunellavulgaris[J].Journal of Tonghua Normal University，2002，23(5):100.(in Chinese)

[8]刘保林，朱丹妮，王刚，等.夏枯草醇提物对小鼠血糖的影响 [J].中国药科大学报，1995，26(1):44-46.

Liu B L,Zhu D N,Wang G,et al.Effect of the alcohol extract ofPrunellavulgarison blood glucose in mice [J].Chinese Pharmaceutical University Journal，1995，26(1):44-46.(in Chinese)

[9]陈瑷.自由基医学 [M].北京:人民军医出版社，1991：283- 286.

Chen A.Free radical medicine [M].Beijing:People’s Medical Publishing House，1991：283-286.(in Chinese)

[10]Farghal I H,Masek K.Immunopharmacologic pharmacologic agent s in the amelioration of hepatic injuries [J].International J of Immunopharmacology,1998,20(45):25-39.

[11]赵铁建，钟振国，方卓，等.百花丹水煎液对四氯化碳慢性肝损伤小鼠肝组织脂质过氧化的影响 [J].广西医科大学学报，2006,23(5)：725-726.

Zhao T J,Zhong Z G，Fang Z,et al.Effect of Baihuadan decoction on lipid peroxidation in liver tissue of mice on chronic liver injury induced by CCl4[J].Journal of Guangxi Medical University，2006,23(5)：725-726.(in Chinese)

[12]Sergent O,Pereira M,Bel homme C,et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes [J].J Pharmacol Exp Ther,2005,313(1):104-111.

[13]Frank V，Eva V，James F D，et al．The role of active oxygen species in plant signal transduction [J].Plant Science，2001，(161)：1405-1414．

[14]Halliwell B,Gutleridge J.Free radical in biology and medicine [M].Oxford：Clanendon Press,1989：106-123.

[15]柳巨雄．兽医临床诊断学 [M].北京：高等教育出版社，2011．

Liu J X.Veterinary clinical diagnosis [M].Beijing:Higher Education Press,2011.(in Chinese)

[16]Ha B,Lee J.The effect of chondroitin sulfate against CCl4-induced hepatotoxicity [J].Bikl Pharm Bull,2003,26(5):622-626.

[17]陈彤，陈荣光.夏枯草对四氯化碳肝损伤小鼠的保护作用 [J].龙岩学院学报，2013，31(2)：17-21.

Chen T,Chen R G.Protective effect ofPrunellavulgarison carbon tetrachloride induced liver injury in mice [J].Journal of Longyan University,2013，31(2)：17-21.(in Chinese)

Protective effects of aqueous extract ofprunellavulgarisL.on hepatic injured mice

CHEN Tong1,2,SU Yue-hua1,HUANG Yu-lin1,QIU Long-xin1,2

(1CollegeofLifeSciences,LongyanUniversity,Longyan,Fujian364000,China；2FujianKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineandVeterinaryBiotechnology,Longyan,Fujian364000,China)

Abstract:【Objective】 This study investigated the protective effects of aqueous extract of prunella vulgaris L.on chronic hepatic injured mice induced by CCl4.【Method】 Water extract of prunella vulgaris L.with concentration of 1 g/mL (in crude drugs) was prepared and administrated by gastric lavage to mice at different doses (0.5,1,and 2 g/kg) for 5 weeks,set up the blank group and model group,its daily lavage the same volume of physiological saline.Four groups of mice were administrated with volume fraction 1% CCl4 vegetable oil solution (5 mL/kg body weight,intraperitoneal injection twice each week for 3 weeks) to establish the chronic hepatic injury model while the control mice were given vegetable oil.16 h after the last intragastric administration,blood was collected and the activities of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) as well as serum malondialdehyde (MDA) concentration were determined.Liver tissues were also homogenized to measure the activities of hepatic lactate dehydrogenase (LDH),catalase (CAT),and superoxide dismutase (SOD),as well as total antioxidant capacity (T-AOC) level.Moreover,liver sections were prepared to observe histopathological changes in tissue.【Result】 Compared with the model group,water extract of prunella vulgaris L.significantly decreased the activities of serum ALT and AST and serum MDA concentration,increased the activities of hepatic CAT and SOD and hepatic T-AOC,and reduced the activity of hepatic LDH.Microscopic observation showed that the hepatic lobule structure of control group mice was severely damaged,no hepatic cords and hepatic sinusoids were found,and hepatic cells were generally denatured.Different dose groups of water extract of prunella vulgaris L.gradually reduced the focus of mice liver tissue,the degeneration phenomena of liver cells in focus was gradually improved,and the structure of liver cords and liver sinusoids gradually appeared again.【Conclusion】 Water extract of prunella vulgaris L.exerted protective effects on chronic hepatic injured mice induced by CCl4,and the mechanisms may be related to its antioxidant effect.

Key words:aqueous extract of Prunella vulgaris L.;CCl4;chronic liver injury;mice

DOI：网络出版时间:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.004

[收稿日期]2014-06-26

[基金项目]福建省教育厅科技B类项目(JB12198)；福建省教育厅科技A类项目(JA13308)

[作者简介]陈彤(1970-)，女，福建龙岩人，副教授，硕士，主要从事生理学研究。E-mail：chen.9376@163.com[通信作者]邱龙新(1969-)，男，福建龙岩人，教授，博士，主要从事天然活性物质开发应用研究。E-mail：qlongxin@tom.com

[中图分类号]S853.7

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)02-0023-05