大豆干旱胁迫下miRNA与mRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

刘伟灿，王　骐，周永刚，邓　宇，赵利旦，王兴超，靳　京，董园园，王　南，王法微，陈　欢，李晓薇，李海燕

(1 吉林农业大学 a 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，b 生命科学学院，吉林 长春130118；2 东北师范大学 附属中学，吉林 长春 130118)



大豆干旱胁迫下miRNA与mRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

刘伟灿1a,1b，王骐2，周永刚1a,1b，邓宇1a,1b，赵利旦1a,1b，王兴超1a,1b，靳京1a,1b，董园园1a,1b，王南1a,1b，王法微1a,1b，陈欢1a,1b，李晓薇1a,1b，李海燕1a,1b

(1 吉林农业大学 a 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，b 生命科学学院，吉林 长春130118；2 东北师范大学 附属中学，吉林 长春 130118)

[摘要]【目的】 通过分析大豆中候选内参基因的稳定性，筛选大豆干旱胁迫处理条件下适合成熟miRNA、前体miRNA及靶基因mRNA荧光定量PCR的内参基因。【方法】 以干旱胁迫处理后的大豆根和叶片为材料，选择了5个成熟miRNAs和5个传统的看家基因作为候选内参基因，利用GeNorm和NormFinder程序对10个候选内参基因的稳定性进行评价。【结果】 在干旱胁迫下，大豆根、叶片中，成熟miRNA定量最合适的单个内参基因分别为miR156a、miR167a，最合适的内参基因组合分别为miR1520d与miR156a、miR1520d与miR167a。前体miRNA和靶基因mRNA定量最合适的单个内参基因分别为Fbox、Act11，最合适的内参基因组合分别为Act11与Fbox、Act11与EF1A。【结论】 筛选出大豆干旱胁迫条件下成熟miRNA、前体miRNA及其对应靶基因mRNA的荧光定量PCR的内参基因，最稳定内参基因数目为2个。

[关键词]大豆；干旱胁迫；荧光定量PCR；内参基因；成熟miRNA；前体miRNA；靶基因mRNA

实时荧光定量PCR(qPCR)因其灵敏度高、成本较低、高通量及方便快捷等优点，已成为样本中基因表达定性与定量的常规方法之一。在qPCR检测基因表达变化过程中，选择适当的内参基因进行标准化，以减少检测样本间的cDNA差异是必须的[1]。理想的内参基因应该在不同试验条件、不同时间、不同组织类型样品中的表达水平均无改变。但近年来的研究发现，在一种试验条件下合适的内参基因并不一定适用另一种试验条件，或者不同植物品种间，或同一植物不同组织中的内参基因可能也是不同的[2-10]。而研究者简单的套用他人试验条件下的稳定内参基因很可能导致出现错误的检测结果。因此，为了获得比较真实可靠的定量结果，通过试验选择适合自身试验体系的、稳定表达的内参基因十分重要。

植物MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源、单链、非编码、小分子RNA。其形成过程存在多种形式，首先在细胞核内内源的miRNA基因转录产生初级转录本(Pri-miRNA)；进一步被DCL1切割后转化为前体miRNA (Pre-miRNA)；再经过Dicer酶酶切后，最终成为长20～24 nt的成熟miRNA(Mature miRNA)。成熟miRNA通过碱基配对结合到与其互补的mRNA的位点，通过诱导靶基因mRNA的降解或阻止其翻译过程来调控植物个体生长发育，并影响其生理过程[11-12]。miRNA作为新的研究热点备受关注的时间不到15年，国内外学者都希望从中挖掘新的有利基因资源及基因调控手段。首先，确定成熟miRNA、前体miRNA及靶基因mRNA的基因表达变化规律，是明确miRNA基因分子调控机制及开展进一步分子生物学研究工作的重要依据。

大豆是人类蛋白质和食用油脂的重要来源。我国每年因干旱造成的大豆减产在所有非生物胁迫中占首位。目前，国内外学者通过高通量测序技术，已完成了大豆在干旱胁迫条件下的小RNA与mRNA转录组测序数据[13-14]。但缺乏大豆干旱胁迫下分析成熟miRNA、前体miRNA及靶基因mRNA的内参基因。因此，本研究选择了5个成熟miRNA和5个传统的看家基因(Housekeeping genes，HKGs)作为候选内参基因，利用GeNorm[15]和NormFinder[16]程序筛选了适合大豆干旱胁迫条件下校准qPCR检测结果的参考基因，为准确检测大豆干旱胁迫处理条件下的基因表达(包括成熟miRNA、前体miRNA及靶基因mRNA)提供参考。

1材料与方法

1.1植物材料的处理

将大豆(Williams 82)在Hoagland培养液中培养至单叶完全展开，改用添加8% PEG 8000的培养液进行胁迫处理，以未进行胁迫处理为对照，于胁迫处理2，4，8 h时采取根和叶片组织，在液氮中速冻后保存在-80 ℃冰箱备用。

1.2RNA的提取

取冻存的样本经液氮研磨后，使用RNAiso plus(Takara)试剂进行总RNA提取。使用NanoDrop2000对RNA的浓度和质量进行测定，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。提取的总RNA保存在-80 ℃冰箱。

1.3cDNA的合成

cDNA的合成采用如下2种试剂体系分别进行反转录：(1)成熟miRNA定量分析模板，采用基于Poly(A)加尾原理的SYBR®PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit(Takara)试剂进行反转录；(2)前体miRNA和mRNA定量分析模板，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser-Perfect Real Time(Takara)试剂反转录，具体步骤参见使用说明。反转录后的cDNA保存在-20 ℃冰箱。

1.4候选内参基因的选择及引物设计

根据前人关于大豆内参基因的稳定性评价报道，选择了5个成熟miRNA[2-5]和5个传统的看家基因[6-10]作为候选内参基因(表1)。在NCBI和miRBase数据库中查找它们的序列信息，使用 Primer 5软件和DNA Star软件进行引物设计。引物设计原则参照Takara公司的Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)和SYBR®PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit-A试剂说明。设计的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。其中，成熟miRNA定量使用的下游引物是通用引物Uni-miR qPCR(Takara)。

表 1　候选内参基因引物设计的相关信息

1.5内参基因的荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(qPCR)采用96孔Mx3000p(Stratagene)实时荧光定量系统，选用Takara公司的Premix EXTaqTM(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂。反应体系为：10 μL SYBR Premix ExTaqTM(2×)，0.4 μL Rox Reference DyeⅡ，2 μL cDNA，成熟miRNA和看家基因定量的Primer(10 μmol/L)分别是0.8和0.4 μL，ddH2O补足20 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 5 s,退火60～62 ℃ 20 s，40个循环；熔解曲线(62～95 ℃)。每个样品设置2个重复及NTC对照。

1.6数据分析

引物的扩增效率(E)和相关系数(R2)由Mx3000p(Stratagene)系统对样本稀释曲线的各稀释点的测定结果自动计算得出。计算公式：E=10(-1/斜率)-1。为了筛选合适的内参基因，本研究分别采用GeNorm[15]和NormFinder[16]程序(http://medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/和 http://moma.dk/normfinder-software)，对大豆干旱胁迫处理后和对照组根和叶片样本中候选内参基因的表达稳定性进行统计学分析。GeNorm程序分析可自动给出各内参基因的平均表达稳定值M，M值越小，基因表达越稳定。同时，GeNorm程序也可给出配对变异数Vn/(n+1)，其显示了准确量化时需要选择的内参基因数目。Vn/(n+1)的选择阈值为0.15，当Vn/(n+1)≤0.15时，表明只需选择n个内参基因作为量化标准，当Vn/(n+1)>0.15时，表明需选择至少n+1 个基因的组合作为量化标准。NormFinder程序可根据基因表达稳定值Stability(S)对候选内参基因的稳定性进行排序，S值越小，基因越稳定。但NormFinder程序与GeNorm程序不同的是，GeNorm程序分析可得到内参基因的最优组合，而NormFinder程序只能选择单个最稳定的内参基因。

2结果与分析

2.1干旱胁迫下提取大豆总RNA的质量检测

利用RNAiso plus(Takara)试剂对干旱胁迫处理后大豆根和叶片样本中的总RNA进行提取，随机抽取6个提取的总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图1)显示，提取的总RNA条带清晰，28S rRNA条带亮度约为18S rRNA的2倍，无降解，无可见的DNA污染。同时，通过NanoDrop2000检测RNA样品中OD260/OD280均在2.0左右，OD260/OD230在1.8～2.0，平均得率为2 287.9 ng/μL(表2)。上述结果表明，提取的总RNA能满足后续试验操作的要求。

图 1　大豆总RNA琼脂糖凝胶电泳结果

样本SamplesOD260/OD280OD260/OD230得率/(ng·μL-1)Yield叶片(未处理)Leaves(Untreated)1.981.882888.9叶片(处理2h)Leaves(Treated2h)2.011.932530.6叶片(处理4h)Leaves(Treated4h)1.901.963253.5叶片(处理8h)Leaves(Treated8h)1.991.892864.3根(未处理)Roots(Untreated)2.051.991864.9根(处理2h)Roots(Treated2h)2.071.921598.6根(处理4h)Roots(Treated4h)2.031.891754.7根(处理8h)Roots(Treated8h)2.041.911547.5

2.2候选内参基因引物的qPCR扩增特性与产物特异性

保证各候选内参基因引物的qPCR扩增效率及扩增产物的特异性,是对内参基因稳定性进行准确评价的重要前提。本研究将混合cDNA样品进行10倍质量浓度梯度稀释后，作为模板进行qPCR分析，制作各内参基因的标准曲线，结果(表3)显示,各标准曲线的相关系数(R2)≥0.990，引物的扩增效率为94.5%～108.8%，说明各内参基因引物的扩增条件最优，扩增效率基本一致。同时，研究结果(图2)显示，各内参基因的熔解曲线都只有明显的单一峰，且不加模板的阴性对照检测不到荧光信号，说明扩增产物的特异性好。上述结果说明，各内参基因引物的扩增特性及产物的特异性均符合qPCR的要求，可用于内参基因的稳定性评价。

表 3　各候选内参基因引物的扩增特性

图 2　各候选内参基因荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线

2.3大豆干旱胁迫下成熟miRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选大豆干旱胁迫下成熟miRNA荧光定量PCR的最适内参基因，本研究分别利用NormFinder和GeNorm程序，评价了在干旱胁迫下大豆根、叶片中5个候选成熟miRNA基因的稳定性,结果见表4和图3。NormFinder分析结果(表4)显示，在根中，miR156a(0.046)的稳定值S最小，表达稳定性最好；在叶片中，miR167a (0.047)的稳定值S最小，表达稳定性最好。GeNorm分析结果(图3)显示，在根中，5个成熟miRNA基因的表达稳定性由高到低依次为miR1520d/miR156a (0.072)> miR397a(0.150)> miR167a(0.233)>miR172a(0.438)(图3A)；在叶片中，5个成熟miRNA基因的表达稳定性由高到低依次为miR1520d/miR167a(0.139)>miR156a(0.149)>miR397a(0.186)>miR172a(0.382)(图3B)。同时，利用GeNorm程序分析配对变异数Vn/(n+1)，结果 (图3)显示，在根中,5个成熟miRNA基因V2/3值为0.062；在叶片中，5个成熟miRNA基因V2/3值为0.046。两组分析中，V2/3值都小于系统推荐的阈值0.15，说明无需引入第3个基因进行校正，最合适的内参基因数目都是2个。综上分析结果显示，由NormFinder和GeNorm 2种程序分析得到的最稳定的基因是一致的，不同的是GeNorm程序分析可得到内参基因的最优组合，而NormFinder程序只选择了单个最稳定的内参基因，即在干旱胁迫下，大豆根、叶片中成熟miRNA荧光定量PCR最合适的一个内参基因分别是miR156a、miR167a；最合适的内参基因组合分别是miR1520d与miR156a、miR1520d与miR167a。

表 4　NormFinder评价大豆干旱胁迫下成熟miRNA候选内参基因的稳定性

图 3　GeNorm软件评价大豆干旱胁迫下成熟miRNA候选内参基因的稳定性

2.4大豆干旱胁迫下前体miRNA及靶基因mRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选大豆干旱胁迫下前体miRNA及靶基因mRNA荧光定量PCR的最适内参基因，本研究分别利用NormFinder和GeNorm程序，评价了干旱胁迫下大豆根、叶片中5个候选看家基因的稳定性,结果见表5和图4。NormFinder分析结果(表5)显示，在根中，Fbox(0.066)的稳定值S最小，表达稳定性最好；在叶片中，Act11(0.078)的稳定值S最小，表达稳定性最好。GeNorm程序分析结果(图4)显示，在根中，5个看家基因的表达稳定性由高到低依次为Act11/Fbox(0.102)>EF1A(0.201)>TUA5(0.269)>TUB4(0.323)(图4A)；在叶片中，5个看家基因的表达稳定性由高到低依次为Act11/EF1A(0.226)>TUB4 (0.268)>TUA5(0.289)>Fbox(0.346)(图4B)。同时，利用GeNorm软件分析配对变异数Vn/(n+1)，结果(图4)显示，在根中，5个看家基因V2/3值为0.083；在叶片中， 5个看家基因V2/3值为0.088，V2/3值都小于系统推荐的阈值 0.15，说明最合适的内参基因数目都是2个。综上所述，NormFinder和GeNorm 2种程序分析得到的最稳定的内参基因基本一致，即在干旱胁迫下，大豆根、叶片中前体miRNA及靶基因mRNA荧光定量PCR的最适单个内参基因分别是Fbox、Act11，最适的内参基因组合分别是Act11与Fbox、Act11与EF1A。

表 5　NormFinder软件评价大豆干旱胁迫下候选看家基因的稳定性

图 4　GeNorm软件评价大豆干旱胁迫下候选看家基因的稳定性

3讨论与结论

实时荧光定量PCR已被广泛应用于基因的表达分析。选择合适的内参基因是运用实时荧光定量PCR对目标基因表达变化进行准确分析的关键。在大豆内参基因表达稳定性相关研究中，Franceli等[2]将“Embrapa 48”和“BR16”品种大豆幼苗移出水培营养液进行干旱胁迫，结果表明在几种非生物胁迫中，成熟候选内参基因miR156b和miR1520d稳定性最好。Ma等[6]研究认为,15% PEG6000干旱胁迫下，在“吉豆7”和“南农1138-2”叶片中，最稳定的内参基因均为TUB4、TUA5和EF1A。

本研究筛选了大豆(Williams 82)在8%PEG8000干旱胁迫条件下成熟miRNA、前体miRNA及其对应靶mRNA基因荧光定量PCR试验中单个最稳定的内参基因和内参基因的最优组合，结果显示，在干旱胁迫下，大豆根、叶片中，成熟miRNA定量最合适的单个内参基因分别为miR156a、miR167a，最合适的内参基因组合分别为miR1520d与miR156a、miR1520d与miR167a；前体miRNA和靶基因mRNA定量最合适的单个内参基因分别为Fbox、Act11，最合适的内参基因组合分别为Act11与Fbox、Act11与EF1A。

综上所述，不同研究者分析得到的大豆干旱胁迫下最稳定内参基因及其组合并不一致，这可能是因为干旱处理条件、大豆品种及取样部位不同造成的。因此，研究者可根据自己具体的试验体系选择合适的内参基因。另外，本研究筛选得到大豆干旱胁迫下最稳定内参基因组合数目均为2个。前人研究发现，在具体试验中选择2个或2个以上的内参基因作为参照可以减弱单一内参基因变化的影响，有助于增加结果的可靠度及精确度[17]。但是，鉴于试验成本及样本量等问题，又需要选择单个稳定的内参基因。总之，本研究从单一基因及基因组合2个方面，分析了大豆干旱胁迫条件下成熟miRNA、前体miRNA及其对应靶基因mRNA荧光定量PCR内参的稳定性，为研究者提供了更加详尽的内参基因参考。

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Selection of reference genes for quantitative polymerase chain reaction of miRNA and mRNA in soybean under drought stress

LIU Wei-can1a,1b,WANG Qi2,ZHOU Yong-gang1a,1b,DENG Yu1a,1b,ZHAO Li-dan1a,1b,WANG Xing-chao1a,1b,JIN Jing1a,1b,DONG Yuan-yuan1a,1b,WANG Nan1a,1b,WANG Fa-wei1a,1b,CHEN Huan1a,1b,LI Xiao-wei1a,1b,LI Hai-yan1a,1b

(1 aMinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment,bCollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2HighSchoolAttachedtoNortheastNormalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to select appropriate reference genes for qPCR of mature miRNAs,Pre-miRNAs and their target mRNA genes in soybean by analyzing the stabilities of candidate reference genes under drought.【Method】 Roots and leaves of soybean after drought stress treatment were used as materials in this experiment,and five mature miRNAs and five traditional housekeeping genes were selected as candidate reference genes to evaluate their stabilities using GeNorm and NormFinder procedures.【Result】 Under drought treatment to soybean,miR156a and miR167a were found to be the most suitable reference gene for qPCR of mature miRNA while miR1520d/miR156a and miR1520d/miR167a were the most suitable reference gene pairs in roots and leaves,respectively.For qPCR of Pre-miRNAs and their target mRNA genes,Fbox and Act11 were the most suitable reference genes while Act11/Fbox and Act11/EF1A were the most suitable reference gene pairs in roots and leaves,respectively.【Conclusion】 Two most suitable reference gene pairs for qPCR of mature miRNAs,Pre-miRNAs and their target mRNA genes under drought stress were obtained,respectively.

Key words:soybean;drought stress;qPCR;reference genes;mature miRNA;Pre-miRNA;target mRNA gene

DOI：网络出版时间:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.009

[收稿日期]2014-05-23

[基金项目]国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08010-002)；国家自然科学基金项目(31271746，31201144)；吉林省发改委项目(JF2012C002-04)

[作者简介]刘伟灿(1983-)，女，吉林长春人，在读博士，主要从事植物抗逆分子生物学与基因工程研究。[通信作者]李海燕(1971-)，女，吉林长春人，教授，博士，博士生导师，主要从事植物抗逆分子生物学与基因工程研究。

[中图分类号]Q-03;S-3

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)02-0061-07

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